ပရိုတင်းဓာတ် K mNGS (အရည်)
Proteinase K သည် ကျယ်ပြန့်သော အလွှာ၏ တိကျသော တည်ငြိမ်သော serine protease ဖြစ်သည်။၎င်းသည် ဆပ်ပြာများပါဝင်သည့်တိုင် မူလပြည်နယ်ရှိ ပရိုတင်းများစွာကို ပြိုကွဲစေသည်။ပုံဆောင်ခဲနှင့် မော်လီကျူးဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ လေ့လာမှုများမှ အထောက်အထားများအရ အဆိုပါအင်ဇိုင်းသည် တက်ကြွသော site catalytic triad (Asp၊39-သူ့69-Ser၂၂၄)ခွဲထွက်ခြင်း၏ ထင်ရှားသောနေရာသည် ပိတ်ဆို့ထားသော အယ်လ်ဖာအမိုင်နိုအုပ်စုများပါရှိသော ကာဘောက်စ်နှင့် အနံ့ရှိသော အမိုင်နိုအက်ဆစ်အုပ်စုနှင့် ကပ်လျက်ရှိသော peptide နှောင်ကြိုးဖြစ်သည်။၎င်း၏ ကျယ်ပြန့်သော တိကျမှုအတွက် အသုံးများသည်။ဤပရိုတင်းဓာတ် K ကို mNGS အတွက် အထူးထုတ်လုပ်ထားသည်။အခြားသော ပရိုတိန်းတင်း K နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ၎င်းတွင် တူညီသော အင်ဇိုင်းစွမ်းဆောင်ရည်ဖြင့် ညစ်ညမ်းမှုနည်းပါးသော နျူကလိစ်အက်ဆစ်ပါရှိသည်၊ ၎င်းသည် မြစ်အောက်ပိုင်း mNGS အပလီကေးရှင်းကို ပိုမိုကောင်းမွန်စေရန် သေချာစေနိုင်သည်။
သိုလှောင်မှုအခြေအနေများ
2-8 ℃ 2 နှစ်
သတ်မှတ်ချက်
| အသွင်အပြင် | အရောင်မရှိသော အရည်မှ အညိုဖျော့ |
| လုပ်ဆောင်ချက် | ≥800 U/ml |
| ပရိုတင်း အာရုံစူးစိုက်မှု | ≥20 mg/ml |
| Nickase | မတွေ့ပါ။ |
| DNase | မတွေ့ပါ။ |
| RNase | မတွေ့ပါ။ |
သတ္တိ
| EC နံပါတ် | ၃.၄.၂၁.၆၄(Tritirachium အယ်လ်ဘမ်မှ ပြန်လည်ပေါင်းစပ်သည်) |
| Isoelectric အမှတ် | ၇.၈၁ |
| အကောင်းဆုံး pH | 7.0- 12.0 ပုံ ၁ |
| အကောင်းဆုံးအပူချိန် | 65 ℃ ပုံ 2 |
| pH တည်ငြိမ်မှု | pH 4.5- 12.5 (25 ℃၊ 16 ဇ) ပုံ 3 |
| အပူတည်ငြိမ်မှု | 50 ℃ အောက် (pH 8.0၊ 30 မိနစ်) ပုံ ၄ |
| သိုလှောင်မှုတည်ငြိမ်မှု | 25 ℃ တွင် 12 လကြာ လှုပ်ရှားမှု 90% ကျော် |
| Activators များ | SDS, ယူရီးယား |
| တားဆေးများ | Diisopropyl fluorophosphate;phenylmethylsulfonyl ဖလိုရိုက် |
လျှောက်လွှာများ
1. မျိုးရိုးဗီဇရောဂါရှာဖွေရေးကိရိယာအစုံ
2. RNA နှင့် DNA ထုတ်ယူမှုသေတ္တာများ
3. တစ်ရှူးများမှ ပရိုတင်းမဟုတ်သော အစိတ်အပိုင်းများကို ထုတ်ယူခြင်း၊ DNA ကဲ့သို့သော ပရိုတင်းအညစ်အကြေးများ ပျက်စီးခြင်း၊ကာကွယ်ဆေးများနှင့် heparin ပြင်ဆင်မှု
4. pulsed electrophoresis ဖြင့် chromosome DNA ကို ပြင်ဆင်ခြင်း။
5. အနောက်တိုင်းစိတ်ကျဉ်းကြပ်
6. Enzymatic glycosylated albumin ဓာတ်များကို ဗီထရိုရောဂါရှာဖွေခြင်းတွင်၊
ကြိုတင်သတိပေးချက်များ
အသုံးပြုသည့်အခါ သို့မဟုတ် အလေးချိန်ချိန်သည့်အခါ အကာအကွယ်လက်အိတ်များနှင့် မျက်မှန်များကို ဝတ်ဆင်ပြီး အသုံးပြုပြီးနောက် လေဝင်လေထွက်ကောင်းအောင်ထားပါ။ဤထုတ်ကုန်သည် အရေပြားဓာတ်မတည့်မှုတုံ့ပြန်မှုနှင့် ပြင်းထန်သောမျက်လုံးယားယံမှုကို ဖြစ်စေနိုင်သည်။ရှူသွင်းမိပါက ဓာတ်မတည့်ခြင်း သို့မဟုတ် ပန်းနာရင်ကျပ်ရောဂါ သို့မဟုတ် အသက်ရှူကျပ်ခြင်းတို့ကို ဖြစ်စေနိုင်သည်။အသက်ရှုလမ်းကြောင်းကို ယားယံစေနိုင်ပါတယ်။
ယူနစ် အဓိပ္ပါယ်
တစ်ယူနစ် (U) ကို 1 μmol ထုတ်လုပ်ရန် casein hydrolyze လိုအပ်သော အင်ဇိုင်းပမာဏအဖြစ် သတ်မှတ်သည်။အောက်ပါအခြေအနေများအောက်တွင် tyrosine တစ်မိနစ်။
ဓာတ်ပစ္စည်းများ ပြင်ဆင်ခြင်း။
Reagent I- နို့ 1g casein ကို 0.1M sodium phosphate solution (pH 8.0) တွင် ပျော်ဝင်ပြီး 65-70 ℃ ရေတွင် 15 မိနစ်ကြာ ပေါက်ဖွားကာ မွှေကာ ပျော်ဝင်ကာ ရေဖြင့် အအေးခံကာ ဆိုဒီယမ်ဟိုက်ဒရောဆိုဒ် pH 8.0 သို့ ချိန်ညှိကာ ပုံသေ ထုထည်၊ 100ml။
Reagent II- 0.1M trichloroacetic acid၊ 0.2M sodium acetate၊ 0.3M acetic acid။
Reagent III: 0.4M Na2CO3ဖြေရှင်းချက်။
Reagent IV - Forint reagent ကို ရေသန့်သန့်ဖြင့် ၅ ကြိမ် ရောမွှေပါ။
ဓာတ်ပြုခြင်း V- အင်ဇိုင်းမှေးမှိန်- 0.1M ဆိုဒီယမ်ဖော့စဖိတ်ဖြေရှင်းချက် (pH 8.0)။
Reagent VI- tyrosine ဖြေရှင်းချက်- 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tyrosine 0.2 နှင့် ပျော်ဝင်သောM HCl ။
လုပ်ထုံးလုပ်နည်း
1. 0.5ml of I reagent I ကို 37 ℃ တွင် ကြိုတင်နွေးထားပြီး 0.5ml of enzyme solution ကို ထည့်ပြီး ရောမွှေပြီး တွင် သားဖောက်ပါ။37 ℃ 10 မိနစ်။
2. တုံ့ပြန်မှုကိုရပ်တန့်ရန် 1ml of reagent II ကို ပေါင်းထည့်ကာ ကောင်းစွာရောမွှေပြီး ပေါက်ဖွားမှုကို မိနစ် 30 ကြာ ဆက်လက်ပြုလုပ်ပါ။
3. Centrifugate တုံ့ပြန်မှုဖြေရှင်းချက်။
4. 0.5ml supernatant ကိုယူ၍ 2.5ml reagent III၊ 0.5ml reagent IV ကိုထည့်ကာ ရောမွှေပြီး 37 ℃ တွင် သားဖောက်ပါ။မိနစ် 30 ။
5. OD၆၆၀OD အဖြစ် သတ်မှတ်ခဲ့သည်။1;အလွတ်ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စု- 0.5ml ဓါတ်ငွေ့ V ကို အင်ဇိုင်းအစားထိုးရန် အသုံးပြုသည်။OD ကိုဆုံးဖြတ်ရန်ဖြေရှင်းချက်၆၆၀OD အဖြစ်2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tyrosine စံမျဉ်းကွေး- 0.5mL ကွဲပြားသော အာရုံစူးစိုက်မှု L-tyrosine ဖြေရှင်းချက်၊ 2.5mL Reagent III၊ 5mL centrifuge tube တွင် 0.5mL Reagent IV၊ 37℃ တွင် ပေါက်ဖွားပြီး မိနစ် 30 ကြာ၊ OD ကို ရှာဖွေပါ။၆၆၀L-tyrosine ၏ မတူညီသော အာရုံစူးစိုက်မှု အတွက်၊ ထို့နောက် Y သည် L-tyrosine အာရုံစူးစိုက်မှု ရှိရာ စံမျဉ်းကွေး Y=kX+b ကို ရရှိသည်၊ X သည် OD ဖြစ်သည်။၆၀၀.
တွက်ချက်မှု
2- စုစုပေါင်းတုံ့ပြန်မှုဖြေရှင်းချက်ပမာဏ (mL)
0.5- အင်ဇိုင်းဖြေရှင်းချက် ပမာဏ (mL)
0.5- chromogenic ဆုံးဖြတ်ချက် (mL) တွင် အသုံးပြုသည့် တုံ့ပြန်မှု အရည်ပမာဏ
10- တုံ့ပြန်ချိန် (မိနစ်)
Df: Dilution မျိုးစုံ
C- အင်ဇိုင်းပြင်းအား (mg/mL)
ကိုးကား
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett(၁၉၇၂);၂၃:၇၇။
2. Wieger U & Hilz H. Biochem ။ဇီဝရုပ်များ။Res.ကွန်မြူနတီ(၁၉၇၁);၄၄:၅၁၃။
3. Hilz, H.et al.၊အီးယူအာရ်။J. Biochem(၁၉၇၅);၅၆:၁၀၃–၁၀၈။
4. Sambrook Jet အယ်လ်။၊ မော်လီကျူးပုံတူပွားခြင်း- ဓာတ်ခွဲခန်းလက်စွဲ၊ 2nd ထုတ်ဝေမှု၊ Cold Spring HarborLaboratory Press၊ Cold Spring Harbor (1989)။
ကိန်းဂဏန်းများ
သဖန်းသီး.1 အကောင်းဆုံး pH
100mM ကြားခံဖြေရှင်းချက်: pH6.0-8.0၊ Na-phosphate;pH8.0-9.0၊ Tris-HCl;pH9.0-12.5၊ Glycine-NaOH။ အင်ဇိုင်းပြင်းအား- 1mg/mL
ပုံ.၂ အကောင်းဆုံးအပူချိန်
20 mM K-phosphate ကြားခံ pH 8.0 တွင် တုံ့ပြန်မှု။အင်ဇိုင်းပြင်းအား: 1 mg/mL
ပုံ.၃ pH တည်ငြိမ်မှု
25 ℃, 16 ဇ-ကုသမှု 50 mM ကြားခံဖြေရှင်းချက်: pH 4.5- 5.5, Acetate;pH 6.0-8.0၊ Na-phosphate;pH 8.0-9.0၊ Tris-HClpH 9.0- 12.5၊ Glycine-NaOH။အင်ဇိုင်းပြင်းအား: 1 mg/mL
ပုံ.၄ အပူ တည်ငြိမ်မှု
50 mM Tris-HCl ကြားခံ၊ pH 8.0 ဖြင့် မိနစ် 30 ကုသမှု။အင်ဇိုင်းပြင်းအား: 1 mg/mL
Fig.5 သိုလှောင်မှု တည်ငြိမ်သည်။ty at 25 ℃
