RTL Reverse Transcriptase
RTL reverse transcriptase သည် 3'→5' exonuclease လုပ်ဆောင်ချက် ကင်းမဲ့ပြီး RNase H လုပ်ဆောင်ချက်ပါရှိသော RNA နမူနာပုံစံ-မူတည်သည့် DNA ပေါ်လီမာရစ်တစ်ခုဖြစ်သည်။ဤအင်ဇိုင်းသည် RNA ၏နောက်ထပ်ကြိုးမျှင်တစ်ခုကို ပေါင်းစပ်ရန်အတွက် ပုံစံခွက်တစ်ခုအနေဖြင့် အသုံးပြုနိုင်ပြီး၊ အထူးသဖြင့် RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification) အတွက် first-strand cDNA ပေါင်းစပ်မှုအတွက် အသုံးချနိုင်သည်။RTL reverse transcriptase 1.0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အာရုံခံနိုင်စွမ်း သိသိသာသာ တိုးတက်လာသည်၊ အပူတည်ငြိမ်မှု ပိုအားကောင်းလာပြီး 65°C တွင် တုံ့ပြန်မှုသည် ပိုမိုတည်ငြိမ်သည်။RTL reverse transcriptase (glycerol free) ကို lyophilized ပြင်ဆင်မှုများ၊ lyophilized RT-LAMP ဓာတ်ပစ္စည်းများ စသည်တို့ကို ပြင်ဆင်ရန် အသုံးပြုနိုင်သည်။
ယူနစ်အဓိပ္ပါယ်
ယူနစ်တစ်ခုသည် poly(A)•oligo(dT)25 ကို template-primer အဖြစ် အသုံးပြု၍ 50°C တွင် မိနစ် 20 အတွင်း အက်ဆစ်မိုးရွာနိုင်သော ပစ္စည်းအဖြစ် dTTP ၏ 1 nmol ကို ပေါင်းစပ်ထားသည်။
အစိတ်အပိုင်းများ
| အစိတ်အပိုင်း | HC5008Aစာ-၀၁ | HC5008Aစာ-၀၂ | HC5008Aစာ-၀၃ |
| RTL Reverse Transcriptase (Glycerol-မပါ) (15U/μL) | 0.1 mL | 1 mL | 10 mL |
| 10×HC RTL ကြားခံ | 1.5 မီလီမီတာ | 4×1.5 mL | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 မီလီမီတာ) | 1.5 မီလီမီတာ | 2 × 1.5 မီလီမီတာ | 3×10 ml |
သိုလှောင်မှုအခြေအနေ
သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးသည် 0°C အောက်တွင်ရှိပြီး -25°C~-15°C တွင် သိမ်းဆည်းပါ။
အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု
- ကျန်ရှိသော လုပ်ဆောင်ချက်Endonuclease-λDNA 1 μg နှင့် RTL2.0 ၏ 15 ယူနစ်ပါရှိသော 50 μL တုံ့ပြန်မှုသည် 37 ℃ တွင် 16 နာရီကြာပေါက်ဖွားသော gel electrophoresis ၏ အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုပုံစံအတိုင်း ပြသသည်။
- ကျန်ရှိသော လုပ်ဆောင်ချက်Exonuclease:Hind Ⅲ 1 μg ပါဝင်သော 50 μL တုံ့ပြန်မှုသည် λDNA ကို ကြေညက်စေပြီး RTL2.0 ၏ 15 ယူနစ်ကို 37 ℃ တွင် 16 နာရီကြာ ပေါက်ဖွားစေသော ဂျယ်လ်အီလက်ထရိုဖိုရစစ် (gel electrophoresis) ၏ အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုပုံစံအတိုင်း ပြသသည်။
- ကျန်ရှိသော လုပ်ဆောင်ချက်Nickase:supercoiled pBR322 1 μg နှင့် RTL2.0 ၏ 15 ယူနစ် ပါဝင်သော 50 μL တုံ့ပြန်မှုသည် 37°C တွင် 4 နာရီကြာ ပေါက်ဖွားလာသော gel electrophoresis ၏ အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုပုံစံအတိုင်း ပြသသည်။
- ကျန်ရှိသော လုပ်ဆောင်ချက်RNase:MS2 RNA ၏ 0.48 μg နှင့် 37°C တွင် 4 နာရီကြာ ပေါက်ဖွားလာသော RTL2.0 ၏ 15 ယူနစ် ပါဝင်သော 10 μL တုံ့ပြန်မှုသည် gel electrophoresis ၏ အနုတ်လက္ခဏာ ထိန်းချုပ်မှုပုံစံအတိုင်း ပြသသည်။
- E. coli gDNA-ဖြင့် တိုင်းတာသည်။E.coliသီးခြား HCD ထောက်လှမ်းခြင်းကိရိယာများ၊ RTL2.0 ၏ 15 ယူနစ်တွင် 1 ထက်နည်းပါသည်။E. coliဂျီနိုအာ။
တုံ့ပြန်မှု စနစ်ထည့်သွင်းခြင်း။
cDNA Synthesis Protocol
| အစိတ်အပိုင်းများ | အတွဲ |
| နမူနာပုံစံ RNA a | ရွေးချယ်ခွင့် |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) သို့မဟုတ် ကျပန်း Primer ရောနှော(60uM) | 2 μL |
| dNTP ရောနှော (10mM တစ်ခုစီ) | 1 μL |
| RNase inhibitor (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL ကြားခံ | 2 μL |
| နူကလီးယားကင်းစင်သောရေ | 20 μLအထိ |
မှတ်စုများ-
1) စုစုပေါင်း RNA ၏အကြံပြုထားသောပမာဏသည် 1ng ~ 1μg ဖြစ်သည်။
2) mRNA ၏အကြံပြုထားသောပမာဏသည် 50ng ~ 100ng ဖြစ်သည်။
သာမို-စက်ဘီးစီးခြင်း အခြေအနေများသည် ပုံမှန်အတိုင်းဖြစ်သည်။ တုံ့ပြန်မှု
| အပူချိန် (°C) | အချိန် |
| 25°Ca | ၅ မိနစ် |
| 55°C | ၁၀ မိနစ်b |
| 80°C | ၁၀ မိနစ် |
မှတ်စုများ-
1) Random Primer Mix ကို အသုံးပြုပါက 25°C တွင် ပေါက်ဖွားသည့် အဆင့်။
2) ပစ်မှတ် primer ရောနှောကိုအသုံးပြုပါက 55°C တွင် 10 ~ 30 မိနစ်ကြာ ပေါက်ဖွားသည့်အဆင့်။
RT-LAMP ပရိုတိုကော
| အစိတ်အပိုင်းများ | အတွဲ | နောက်ဆုံး အာရုံစူးစိုက်မှု |
| နမူနာပုံစံ RNA | ရွေးချယ်ခွင့် | ≥10 အုပ် |
| dNTP ရောနှော (10mM) | 3.5 μL | 1.4 မီလီမီတာ |
| FIP/BIP Primers (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 Primers (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase inhibitor (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/Reaction |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/တုံ့ပြန်မှု |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaction |
| MgSO4 (100 မီလီမီတာ) | 1.5 μL | 6 mM (စုစုပေါင်း 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (သို့မဟုတ် 10×HC Bst V2 Buffer) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| နူကလီးယားကင်းစင်သောရေ | 25 μL အထိ | - |
မှတ်စုများ-
1) စုဆောင်းရန် vortexing နှင့် centrifuge တိုတိုဖြင့်ရောနှောပါ။အပူချိန် 65 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် 1 နာရီကြာ အဆက်မပြတ်ပေါက်ဖွားခြင်း။
2) ကြားခံနှစ်ခုသည် အပြန်အလှန်လုပ်ဆောင်နိုင်ပြီး တူညီသောဖွဲ့စည်းမှုရှိသည်။
မှတ်စုများ
1. ဤထုတ်ကုန်သည် -20°C တွင် သိမ်းဆည်းထားသောအခါတွင် ဤထုတ်ကုန်သည် အဖြူရောင် အစိုင်အခဲတစ်ခု ဖြစ်လာလိမ့်မည်။-20°C မှထုတ်၍ ရေခဲပေါ်တွင် 10 မိနစ်ခန့်ထားပါ။အရည်ပျော်ပြီးနောက် လှုပ်ခါပြီး ရောစပ်ခြင်းဖြင့် အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။
2.cDNA ထုတ်ကုန်ကို -20°C သို့မဟုတ် -80°C တွင် သိမ်းဆည်းထားနိုင်သည် သို့မဟုတ် PCR တုံ့ပြန်မှုအတွက် ချက်ချင်းအသုံးပြုနိုင်သည်။
3. RNase ညစ်ညမ်းမှုကို ကာကွယ်ရန်၊ စမ်းသပ်ဧရိယာကို သန့်ရှင်းထားပါ၊ ခွဲစိတ်နေစဉ်အတွင်း သန့်ရှင်းသော လက်အိတ်များနှင့် နှာခေါင်းစည်းများ ဝတ်ဆင်ပါ။
