တိုက်ရိုက် PCR Kit ကိုစိုက်ပါ။
ကြောင်နံပါတ်- HCR2020A
Plant Direct PCR Kit သည် အပင်အရွက်များ၊ အစေ့များ စသည်တို့ကို တိုက်ရိုက်ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် သင့်လျော်ပြီး polysaccharides နှင့် polyphenols မပါဝင်သည့် အပင်နမူနာများကို မြင့်မားသောအထွက်နှုန်းကို စစ်ဆေးရန်အတွက် အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ်အပေါ်အခြေခံ၍ တိုက်ရိုက်ချဲ့ထွင်ထားသော DNA polymerase သည် အပင်များရှိ PCR inhibitors များကို သာလွန်သောခံနိုင်ရည်ရှိသည်။ဤအတောအတွင်း၊ ၎င်းသည် 5 kb အတွင်း DNA အပိုင်းများကို ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် သင့်လျော်သော မြင့်မားသော အသံချဲ့စက်စွမ်းဆောင်ရည်ကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။ပစ္စည်းအစုံရှိ ထူးခြားသော Lysis ကြားခံ A ကို လတ်ဆတ်သော သို့မဟုတ် အေးခဲထားသော အပင်တစ်ရှူးများကို lyse လုပ်ရန် အသုံးပြုနိုင်သည်။၎င်းသည် လည်ပတ်ရန် လွယ်ကူပြီး lysate ကို သန့်စင်ခြင်းမရှိဘဲ ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် ပုံစံတစ်ခုအဖြစ် အသုံးပြုနိုင်သည်။၎င်းစနစ်တွင် အကြမ်းထည်နမူနာများကို ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲပြီး ရောနှောပြီးနောက် ထိရောက်စွာ ချဲ့ထွင်နိုင်စေမည့် အကာအကွယ်အေးဂျင့်များ ပါရှိသည်။2 × Plant Direct Master Mix သည် ချဲ့ထွင်မှုတုံ့ပြန်မှုကို လုပ်ဆောင်ရန်အတွက် primer နှင့် templates များကိုသာ ပေါင်းထည့်ရန် လိုအပ်ပြီး၊ ထို့ကြောင့် pipetting operations များကို လျှော့ချပြီး detection throughput နှင့် result of reproductibility ကို ပိုမိုကောင်းမွန်စေပါသည်။
အစိတ်အပိုင်းများ
| အစိတ်အပိုင်းများ | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1.25 ml | 4×1.25 ml |
| တိုက်ရိုက် Lysis Buffer A ကိုစိုက်ပါ။ | 5 ml | 20 ml |
| တိုက်ရိုက် Lysis Buffer B* ကို စိုက်ပါ။ | 5 ml | 20 ml |
*Plant Direct Lysis Buffer B သည် နမူနာများ၏ သိုလှောင်မှုအချိန်ကို တာရှည်ခံရန်အတွက် Plant Direct Lysis Buffer A ကို ပျက်ပြယ်စေသော ရွေးချယ်နိုင်သော ဓာတ်ပစ္စည်းများဖြစ်သည်။ပကတိအခြေအနေအရ အသုံးချနိုင်ပါတယ်။
သိုလှောင်မှုအခြေအနေများ
2 × Plant Direct Master Mix ကို -30 ~ -15 ℃ တွင် သိမ်းဆည်းပြီး ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲပြီး အရည်ပျော်ခြင်းကို ရှောင်ကြဉ်ပါ။တိုက်ရိုက် Lysis Buffer ကိုစိုက်ပါ၊ -30 ~ -15 ℃ သို့မဟုတ် 2 ~ 8 ℃ တွင် သိမ်းဆည်းပါ။
စမ်းသပ်မှု လုပ်ငန်းစဉ်
နမူနာလုပ်ဆောင်ခြင်း။–အပင်အရွက်
တိုက်ရိုက်နည်းလမ်း-အရွက်နုများကို အသုံးပြုရန် အကြံပြုထားသည်။သေးငယ်ပြီး တူညီသောနမူနာတစ်ခုရရှိရန် ပုံသေအချင်း 0.5 မှ 3 မီလီမီတာရှိသော အပေါက်ဖောက်စက်ကို အသုံးပြုပါ၊ ထို့နောက် နမူနာကို PCR စနစ်သို့ တိုက်ရိုက်ထည့်ပါ (50 μl စနစ်အား အကြံပြုထားသည်)။မှတ်ချက်၊ နမူနာသည် PCR ဖြေရှင်းချက်တွင်ရှိပြီး ပြွန်နံရံနှင့်မထိကြောင်း သေချာပါစေ။ရှည်လျားသောအပိုင်းအစများနှင့် ရှုပ်ထွေးသောနမူနာများကို ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် တိုက်ရိုက် PCR ကိုအသုံးပြုပါက၊ နမူနာပုံစံတစ်ခုအနေဖြင့် ပိုမိုသေးငယ်သောအချင်း (0.5 – 1 မီလီမီတာ) ကိုအသုံးပြုခြင်းဖြင့် ပိုမိုကောင်းမွန်သောရလဒ်များရရှိရန် ကူညီပေးနိုင်ပါသည်။
ကြိတ်ခွဲခြင်းနည်းလမ်းအရွက်နုများကို အသုံးပြုရန် အကြံပြုထားသည်။အရွက်ငယ်တစ်ပိုင်း (အချင်း ၁ – ၃ မီလီမီတာခန့်) ကို 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab တွင် ထားကာ တတ်နိုင်သမျှ ကြိတ်ချေပါ (ဤအဆင့်တွင် အရွက်ကို 100 μl ပိုက်ထိပ်ဖျားဖြင့် ညှစ်ခြင်းဖြင့် လုပ်ဆောင်နိုင်ပါသည်။ နမူနာကို ကြိတ်ချေရန်။)အရွက်တစ်ရှူး ပမာဏ ပိုများသော (၇ မီလီမီတာ ထက်မပိုပါ) ကို အသုံးပြုပါက၊ ပျော့ပြောင်းမှုကြားခံ၏ ထုထည်ကို 50 μl အထိ တိုးပါ။အရွက်များမြေကျပြီးနောက်, အရည်သည်အစိမ်းရောင်ဖြစ်သင့်သည်။အတိုချုံး centrifugation ပြီးနောက်၊ တုံ့ပြန်မှု ပုံစံခွက်အဖြစ် PCR စနစ်သို့ supernatant 1 μl ကို ပေါင်းထည့်ပါ။
အပူဓာတ်ခွဲနည်း-အရွက်နုများကို အသုံးပြုရန် အကြံပြုထားသည်။အရွက်ငယ်တစ်ပိုင်း (အချင်း ၁ – ၃ မီလီမီတာခန့်) ကို 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A တွင် ထားကာ 95°C ဖြင့် အပူပေးပြီး 5 – 10 မိနစ်ခန့်ထားပါ။lyse လုပ်ရန်ခက်ခဲသောအရွက်များအတွက် lysis အချိန်ကို သင့်လျော်စွာ တိုးမြှင့်နိုင်သည် (မိနစ် 20 ထက်မပို)။အရွက်တစ်ရှူး ပမာဏ ပိုများသော (၇ မီလီမီတာ ထက်မပိုပါ) ကို အသုံးပြုပါက ပျော့ပြောင်းမှု ကြားခံ၏ ထုထည်ကို 50 μl အထိ တိုးပါ။အပူပေးပြီးနောက်၊ ခဏတာ centrifuge လုပ်ပြီး တုံ့ပြန်မှုပုံစံပုံစံတစ်ခုအဖြစ် PCR စနစ်သို့ supernatant 1 μl ထည့်ပါ။
နမူနာလုပ်ဆောင်ခြင်း။- မျိုးစေ့
ကြိတ်ခွဲခြင်းနည်းလမ်းအချင်း 5 မီလီမီတာရှိသော မျိုးစေ့များကို လှီးဖြတ်ရန် ဦးရေပြားကို အသုံးပြု၍ Plant Direct Lysis Buffer A ၏ 100 μl ထဲသို့ ထည့်ကာ နမူနာကို pipette ထိပ်ဖျား သို့မဟုတ် အခြားကိရိယာများဖြင့် ကြိတ်ချေပါ။Vortex ကို အတိုချုံးပြီး အခန်းအပူချိန်မှာ ၃-၅ မိနစ်လောက် ထားပေးပါ။အစေ့နမူနာကို ပျော့ပျောင်းသည့်ကြားခံတွင် နစ်မြုပ်ကြောင်း သေချာပါစေ။အတိုချုံး centrifugation ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ တုံ့ပြန်မှုပုံစံအဖြစ် PCR စနစ်သို့ supernatant 1 μl ကို ပေါင်းထည့်ပါ။
အပူဓာတ်ခွဲနည်း-အချင်း 5 မီလီမီတာရှိသော မျိုးစေ့များကို လှီးဖြတ်ရန် ဦးရေပြားကို အသုံးပြု၍ Plant Direct Lysis Buffer A ၏ 100 μl ထဲသို့ ထည့်ကာ 95°C ဖြင့် အပူပေးကာ 5-10 မိနစ်ခန့်ထားပါ။lyse လုပ်ရန်ခက်ခဲသောအရွက်များအတွက် lysis အချိန်ကို သင့်လျော်စွာ တိုးမြှင့်နိုင်သည် (မိနစ် 30 ထက်မပို)။အပူပေးပြီးနောက်၊ အာရုံစူးစိုက်မှုအား အကျဉ်းချုံးပြီး တုံ့ပြန်မှုပုံစံပုံစံတစ်ခုအနေဖြင့် PCR စနစ်သို့ 1 μl supernatant ပေါင်းထည့်ပါ။
aသင့်လျော်သောအရွယ်အစားနမူနာများကိုဖြတ်ရန် ကတ်ကြေး သို့မဟုတ် အခြားကိရိယာများကိုလည်း အသုံးပြုနိုင်သည်။ဖောက်စက် သို့မဟုတ် ကတ်ကြေးကို ပြန်လည်အသုံးပြုပါက၊ နမူနာများကြားတွင် ညစ်ညမ်းမှုကို တားဆီးရန်အတွက် အသုံးတိုင်းတွင် အသုံးမပြုမီ 2% sodium hypochlorite solution ဖြင့် သန့်စင်သင့်ပါသည်။
ခအသုံးမပြုမီ Plant Direct Lysis Buffer သည် အပြည့်အဝ အရည်ပျော်ကြောင်း သေချာပါစေ။ကြားခံသည် ပျစ်သည် သို့မဟုတ် မိုးရွာပါက အသုံးမပြုမီ ၎င်းကို လုံးဝ အရည်ပျော်စေရန် 37 ℃ တွင် အပူပေးနိုင်သည်။
ဂ။ဓါတ်ပြုမှုစနစ်ရှိ ပုံစံခွက်၏ ထုထည်ပမာဏကို အပင်ထွက်ပစ္စည်း၏ ထုထည်နှင့် အရောအနှောထည့်သွင်းမှု ကွာခြားမှုအရ သင့်လျော်စွာ ချိန်ညှိနိုင်သည်။
တိုက်ရိုက် Lysis Buffer ကိုစိုက်ပါ။
ဤထုတ်ကုန်တွင်ပါရှိသော Plant Direct Lysis Buffer A ကို အပင်တစ်သျှူးအများစု၏ genome ကို ထုတ်လွှတ်ရန် တင်းကြပ်စွာ ပြုပြင်ထားပြီး အပင်ကြမ်းများကို 4°C တွင် ရေတိုသိုလှောင်ရန်အတွက် သင့်လျော်ပါသည်။နမူနာအား အချိန်ပိုကြာအောင် သိမ်းဆည်းထားရန် လိုအပ်ပါက (ဥပမာ၊ 1-2 လ)၊ supernatant ကို EP tube အသစ်သို့ လွှဲပြောင်းပြီး -20 ℃ တွင် သိမ်းဆည်းရန် အကြံပြုအပ်ပါသည်။နမူနာများကို ပိုမိုတည်ငြိမ်စွာ သိမ်းဆည်းရန်အတွက် Plant Direct Lysis Buffer B ၏ တူညီသော ပမာဏကို လွှဲပြောင်းထားသော supernatant သို့ ရောမွှေပြီး -20 ℃ တွင် သိမ်းဆည်းပါ။တည်ငြိမ်သော သိုလှောင်ချိန်သည် အပင်နမူနာများနှင့် ပြည်နယ်များအလိုက် ကွဲပြားသည်။
တုံ့ပြန်မှုစနစ်
| ddH2O | 20.0 µl သို့ | 50.0 µl သို့ |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10.0 µl | 25.0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| အရွက်/ကြမ်းထုတ်ယူနမူနာ(နမူနာလုပ်ဆောင်ခြင်းကို ကိုးကားပါ) | 0.5 – 3 မီလီမီတာ အရွက်ပြား/x µl | 0.5 – 3 မီလီမီတာ အရွက်ပြား/x µl |
aMg ပါဝင်ပါတယ်။2+နောက်ဆုံးအာရုံစူးစိုက်မှု 2 mM တွင်။
ခprimer တစ်ခုစီအတွက် နောက်ဆုံးအာရုံစူးစိုက်မှု 0.4μM ကို အသုံးပြုရန် အကြံပြုထားသည်။Primer များကို အလွန်အကျွံအသုံးပြုခြင်းသည် အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုကို တိုးပွားစေသည်။
ဂ။အသုံးပြုထားသော နမူနာပမာဏကို ပကတိအခြေအနေအရ ချိန်ညှိနိုင်သည်။အကြမ်းဖျင်း lysed နမူနာ၏ တုံ့ပြန်မှုတစ်ခုတည်းတွင် အသုံးပြုသည့်ပမာဏကို တုံ့ပြန်မှုစုစုပေါင်းပမာဏ၏ 2% မှ 20% ကြား ချိန်ညှိနိုင်သည်။နမူနာများကို အလွန်အကျွံအသုံးပြုခြင်းသည် အသံချဲ့စက်ချို့ယွင်းမှုကို ဖြစ်စေနိုင်သည်။
တုံ့ပြန်မှုအစီအစဉ်
| ခြေလှမ်းများ | အပူချိန် | အချိန် |
| ကနဦးအသွင်အပြင် | 98 ℃ | ၅ မိနစ် |
| Denaturation | 95 ℃ | 10 စက္ကန့် |
| ဖြာထွက်ခြင်း။ | 58 ~ 72 ℃ | 15 စက္ကန့် |
| တိုးချဲ့မှု | 72 ℃ | 30 စက္ကန့် |
| နောက်ဆုံး တိုးချဲ့မှု | 72 ℃ | ၅ မိနစ် |
aကနဦး အသွင်အပြင် (98 ℃၊ 5 မိနစ်) သည် အပင်တစ်သျှူးများကို ခွဲထုတ်ပြီး PCR ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် အသုံးပြုနိုင်သည့် မျိုးဗီဇ DNA ကို ထုတ်လွှတ်ပေးသည်။အချိန်ကို တိုစေခြင်း သို့မဟုတ် အပူချိန်ကို လျှော့ချခြင်း မပြုပါနှင့်။
ခPrimer Tm တန်ဖိုး သို့မဟုတ် Tm တန်ဖိုးထက် 2 ~ 4 ℃ မြင့်မားသည်ဟု သတ်မှတ်ရန် အကြံပြုထားသည်။ဤထုတ်ကုန်တွင်အသုံးပြုသည့် တိုက်ရိုက်ချဲ့ထွင်သည့် DNA polymerase သည် သမားရိုးကျ Taq DNA polymerase နှင့် ကွဲပြားသည်၊ တုံ့ပြန်မှု annealing temperature အတွက် အထူးလိုအပ်ချက်များရှိသည်; မြင့်မားသော annealing အပူချိန်ကိုအသုံးပြုခြင်းသည် အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်ကို ထိထိရောက်ရောက် လျှော့ချနိုင်ပြီး ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှုကို တိုးတက်စေသည်။ရှုပ်ထွေးသော template များအတွက်၊ annealing temperature ကို ချိန်ညှိခြင်းနှင့် extension time ကို ကြာရှည်စေခြင်းဖြင့် ထိရောက်သော ချဲ့ထွင်မှုကို ရရှိနိုင်သည်။
ဂ။အသံချဲ့စက်၏ အရှည်မှာ ≤1 kb ဖြစ်ပါက၊ တိုးချဲ့ချိန်ကို 30 sec/kb ဖြင့် သတ်မှတ်သည်။အသံချဲ့စက်၏ အရှည်သည် > 1 kb ဖြစ်ပါက၊ တိုးချဲ့ချိန်ကို 60 sec/kb ဖြင့် သတ်မှတ်သည်။
ဃ။ချဲ့ထွင်မှုနည်းသော အထွက်နှုန်းနည်းသော ရှုပ်ထွေးသောနမူနာများ သို့မဟုတ် နမူနာများအတွက်၊ သံသရာအရေအတွက်အား သင့်လျော်စွာ 40 -50 cycles အထိ တိုးမြှင့်နိုင်သည်။
လျှောက်လွှာများ
၎င်းသည် အပင်တစ်ရှူးများကို တိုက်ရိုက်ချဲ့ထွင်ခြင်းနှင့် ပိုလီဆက်ကာခရိုက်နှင့် ပိုလီဖီနောများမပါဝင်သည့် အပင်နမူနာများ၏ မြင့်မားသောအထွက်နှုန်းကို စစ်ဆေးခြင်းအတွက် သက်ဆိုင်ပါသည်။
မှတ်စုများ
သုတေသနအတွက်သာ အသုံးပြုသည်။ရောဂါရှာဖွေရေးလုပ်ငန်းစဉ်များတွင် အသုံးပြုရန်မဟုတ်ပါ။
1. အပင်ချဲ့ထွင်ခြင်း သို့မဟုတ် တိုက်ရိုက်ချဲ့ထွင်ခြင်းအတွက်၊ စနစ်၊ primers နှင့် လုပ်ဆောင်မှုများ မှန်ကန်ကြောင်း သေချာစေရန် စမ်းသပ်မှုမစတင်မီ အပြုသဘောဆောင်သော ထိန်းချုပ်မှုတစ်ခုအဖြစ် သန့်စင်ထားသော မျိုးဗီဇ DNA ကို အသုံးပြုရန် အကြံပြုထားသည်။
2. ဤကိရိယာတွင်သုံးသော တိုက်ရိုက်ချဲ့ထွင်သည့် DNA ပေါ်လီမာရစ်သည် ပြင်းထန်သော အထောက်အထားဖတ်ခြင်းဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်မှု ရှိသည်။TA cloning ပြုလုပ်ရန် လိုအပ်ပါက၊ adenine မထည့်မီ DNA ကို သန့်စင်ရန် အကြံပြုထားသည်။
3. Primer Design လမ်းညွှန်-
aprimer ၏ 3′ ၏နောက်ဆုံးအခြေခံသည် G သို့မဟုတ် C ဖြစ်သင့်သည်ဟုအကြံပြုထားသည်။
ခprimer ၏ 3′ အဆုံးတွင် နောက်ဆုံးခြေစွပ် 8 ခုတွင် ဆက်တိုက်မတူညီမှုများကို ရှောင်ရှားသင့်သည်။ဂ။primer ၏ 3′ အဆုံးတွင် ဆံညှပ်ပုံစံများကို ရှောင်ကြဉ်ပါ။
ဃ။ရှေ့သွား primer ၏ Tm တန်ဖိုးနှင့် ပြောင်းပြန် primer သည် 1 ℃ထက်မပိုသင့်ဘဲ Tm တန်ဖိုးကို 60 ~ 72 ℃ ( Primer Premier 5 မှ Tm တန်ဖိုးကို တွက်ချက်ရန် အကြံပြုထားသည်)။
ငပုံစံပလိတ်နှင့် မကိုက်ညီသော အပို primer အတွဲများကို primer Tm တန်ဖိုးကို တွက်ချက်ရာတွင် မပါဝင်သင့်ပါ။
fPrimer ၏ GC ပါဝင်မှုသည် 40% -60% ဖြစ်ရန် အကြံပြုထားသည်။
ဆprimer တွင် A, G, C နှင့် T ၏ အလုံးစုံ ဖြန့်ကျက်မှုသည် တတ်နိုင်သမျှ ညီနေသင့်သည်။GC သို့မဟုတ် AT အကြောင်းအရာများ မြင့်မားသော ဒေသများကို အသုံးပြုခြင်းမှ ရှောင်ကြဉ်ပါ။
ဇprimer အတွင်း သို့မဟုတ် primer နှစ်ခုကြားတွင် 5 သို့မဟုတ် ထို့ထက်ပိုသော bases ၏ ဖြည့်စွက်အစီအစဥ်များ ရှိနေခြင်းကို ရှောင်ကြဉ်ပြီး primer နှစ်ခု၏ 3′ အဆုံးတွင် 3′ သို့မဟုတ် ထို့ထက်ပိုသော bases များ၏ ဖြည့်စွက်စာများ ရှိနေခြင်းကို ရှောင်ကြဉ်ပါ။
ဈ။အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်ကို တားဆီးရန် primer ၏ တိကျမှုကို စစ်ဆေးရန် NCBI BLAST လုပ်ဆောင်ချက်ကို အသုံးပြုပါ။
