Rnase Inhibitor
Murine RNase inhibitor သည် E.coli မှထုတ်လွှတ်သော recombinant murine RNase inhibitor ဖြစ်သည်။၎င်းသည် RNase A၊ B သို့မဟုတ် C နှင့် 1:1 အချိုးမညီသော ကာဗယ်လက်ဆက်နှောင်ခြင်းမှတဆင့် ချိတ်ဆက်ပြီး အင်ဇိုင်းသုံးမျိုး၏လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဟန့်တားကာ RNA ပျက်စီးခြင်းမှ ကာကွယ်ပေးသည်။သို့သော်၊ ၎င်းသည် RNase 1၊ RNase T1၊ S1 Nuclease၊ RNase H သို့မဟုတ် Aspergillus မှ RNase ကို ထိရောက်စွာ မနှိမ်နင်းနိုင်ပါ။Murine RNase inhibitor ကို RT-PCR၊ RT-qPCR နှင့် IVT mRNA တို့မှ စမ်းသပ်ခဲ့ပြီး၊ အမျိုးမျိုးသော စီးပွားဖြစ် Reverse transcriptases၊ DNA polymerases နှင့် RNA polymerases တို့နှင့် တွဲဖက်အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။
လူသား RNase inhibitors များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက murine RNase inhibitor တွင် inhibitor ၏အသက်မဝင်ခြင်းကိုဖြစ်စေသည့် ဓာတ်တိုးမှုကို လွန်စွာထိခိုက်လွယ်သော cysteine နှစ်ခုမပါဝင်ပါ။၎င်းသည် DTT ၏ပါဝင်မှုနည်းသော (1 mM) ထက် တည်ငြိမ်စေသည်။ဤအင်္ဂါရပ်သည် DTT ၏ ပြင်းအား မြင့်မားသော တုံ့ပြန်မှု (ဥပမာ- အချိန်နှင့်တပြေးညီ RT-PCR) တွင် အသုံးပြုရန် သင့်လျော်စေသည်။
Aလျှောက်လွှာ
RNA ပြိုကွဲခြင်းကို ရှောင်ရှားရန် RNase နှောင့်ယှက်မှုကို ရှောင်ရှားရန် ဖြစ်နိုင်သည့် မည်သည့်စမ်းသပ်မှုတွင်မဆို ဤထုတ်ကုန်ကို တွင်ကျယ်စွာ အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။
1.cDNA၊ RT-PCR၊ RT-qPCR စသည်တို့၏ ပထမကြိုးမျှင်ကို ပေါင်းစပ်ခြင်း။
2.in vitro ကူးယူခြင်း/ဘာသာပြန်ခြင်းတွင် RNA ပြိုကွဲခြင်းမှ ကာကွယ်ပေးသည် (ဥပမာ၊ in vitro viral replication စနစ်)။
3.RNA ခွဲခြားခြင်းနှင့် သန့်စင်နေစဉ်အတွင်း RNase လုပ်ဆောင်မှုကို တားမြစ်ခြင်း။
သိုလှောင်မှုအခြေအနေများ
ထုတ်ကုန်ကို -25 ~ 15 ℃ တွင် သိမ်းဆည်းနိုင်ပြီး သက်တမ်း 2 နှစ်။
သိုလှောင်မှုကြားခံ
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃), 8 mM DTT နှင့် 50% glycerol ။
ယူနစ် အဓိပ္ပါယ်
50% ဖြင့် ribonuclease A ၏ 5ng လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဟန့်တားရန်အတွက် murine RNase inhibitor လိုအပ်သောပမာဏကို တစ်ယူနစ် (U) အဖြစ် သတ်မှတ်ခဲ့သည်။
ပရိုတင်း၏မော်လီကျူးအလေးချိန်
murine RNase inhibitor ၏ မော်လီကျူးအလေးချိန်သည် 50 kDa ဖြစ်သည်။
အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု
Exonuclease လုပ်ဆောင်ချက်-
1 μg λ -Hind III ပါသော murine RNase inhibitor ၏ 40 U သည် DNA ကို 37 ℃ တွင် 16 နာရီကြာ ချေဖျက်နိုင်ပြီး agarose gel electrophoresis မှသတ်မှတ်ထားသည့်အတိုင်း ပျက်စီးခြင်းမရှိပါ။
Endonuclease လုပ်ဆောင်ချက်
37 ℃ တွင် 16 ℃ တွင် 1μ g λ DNA ပါသော murine RNase inhibitor ၏ 40 U သည် agarose gel electrophoresis မှသတ်မှတ်ထားသည့်အတိုင်း ပြိုကွဲခြင်းမရှိပါ။
Nicking လုပ်ဆောင်ချက်-
37 ℃ တွင် 1μ g pBR322 ပါသော murine RNase inhibitor ၏ 40U သည် 16 နာရီကြာ agarose gel electrophoresis မှသတ်မှတ်ထားသည့်အတိုင်းပြိုကွဲခြင်းမရှိပါ။
RNase လုပ်ဆောင်ချက်:
37 ℃ တွင် 4 နာရီကြာ 1.6μ g MS2 RNA ပါသော murine RNase inhibitor ၏ 40U သည် agarose gel electrophoresis မှသတ်မှတ်ထားသည့်အတိုင်း ပြိုကွဲခြင်းမရှိပါ။
E.coli DNA
murine RNase inhibitor ၏ 40 U ကို TaqMan qPCR ဖြင့် E. coli 16S rRNA locus အတွက် သီးသန့် primers ဖြင့် E. coli genomic DNA ပါဝင်မှုကို စစ်ဆေးသည်။E. coli မျိုးရိုးဗီဇ DNA ညစ်ညမ်းမှုသည် ≤ 0.1 pg/40 U ဖြစ်သည်။
Notes
1.Violent oscillation သို့မဟုတ် နှိုးဆော်ခြင်းသည် အင်ဇိုင်းမလှုပ်ရှားခြင်းကို ဦးတည်စေသည်။
2.ဤ inhibitor ၏အကောင်းဆုံးအပူချိန်အကွာအဝေးသည် 25-55 ℃ဖြစ်ပြီး 65 ℃နှင့်အထက်တွင်အသက်မဝင်ပါ။
3. RNase H၊ RNase 1 နှင့် RNase T1 တို့၏ လှုပ်ရှားမှုများကို murine RNase inhibitor မှ တားဆီးထားခြင်းမရှိပါ။
4. RNase လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဟန့်တားခြင်းကို pH ၏ကျယ်ပြန့်သောအကွာအဝေးတွင်တွေ့ရှိခဲ့သည် (pH 5-9 အားလုံးတက်ကြွစွာရှိသည်) နှင့်အမြင့်ဆုံးလုပ်ဆောင်ချက်ကို pH 7-8 တွင်တွေ့ရှိခဲ့သည်။
5. ribonuclease များသည် ပုံမှန်အားဖြင့် denaturing အခြေအနေအောက်တွင် လှုပ်ရှားမှုကို ထိန်းသိမ်းထားသောကြောင့်၊ ribonuclease နှင့် ရှုပ်ထွေးသော RNase Inhibitor မော်လီကျူးများ denaturing မဖြစ်စေရန် ဂရုပြုရပါမည်။တက်ကြွသော ribonuclease ထွက်လာခြင်းကို တားဆီးရန်၊ အပူချိန် 50°C ထက်များပြီး ယူရီးယား သို့မဟုတ် အခြားသော denaturing agent များပါဝင်မှု မြင့်မားခြင်းကို ရှောင်ကြဉ်သင့်သည်။
