EndoFree Plasmid Maxi Kit
ဤကိရိယာသည် ဘက်တီးရီးယားများကို ချေမှုန်းရန်အတွက် ပိုမိုကောင်းမွန်သော SDS-alkaline lysis နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ တစ်ညလုံး မွေးမြူထားသော ဘက်တီးရီးယားပျော်ရည် 150 မှ 300 ml မှ ထုတ်ယူရန်အတွက် သင့်လျော်ပါသည်။အကြမ်းဖျင်းထုတ်ယူမှုကို ထူးခြားသော Endotoxin Scavenger နှင့် ရွေးချယ်ပေါင်းစပ်ထားပြီး endotoxin များကိုဖယ်ရှားရန်အတွက် centrifugation ဖြင့် ပိုင်းခြားထားသည်။ထို့နောက်၊ စီလီကာဂျယ်အမြှေးပါးသည် ဆားမြင့်မားပြီး pH နိမ့်သောအခြေအနေများအောက်တွင် ဖြေရှင်းချက်တွင် ပလာစမစ် DNA နှင့် ပေါင်းစပ်သည်။၎င်းနောက်တွင် အညစ်အကြေးများနှင့် အခြားဘက်တီးရီးယား အစိတ်အပိုင်းများကို ဖယ်ရှားရန် လက်ဆေးကြားခံကို ထပ်ဖြည့်ပေးသည်။နောက်ဆုံးတွင်၊ ဆားနည်းသော၊ pH မြင့်မားသော ကြားခံကို ဆီလီကွန်မက်ထရစ်အမြှေးမှ သန့်စင်သော plasmid DNA ကို ချေဖျက်ရန်အတွက် အသုံးပြုသည်။ဆီလီကာဂျယ် အမြှေးပါးတွင် အထူးစုပ်ယူနိုင်သော အမြှေးပါးကို အသုံးပြုထားပြီး ကော်လံနှင့် ကော်လံကြားရှိ စုပ်ယူမှုပမာဏ ကွာခြားချက်မှာ အလွန်သေးငယ်ပြီး ထပ်တလဲလဲနိုင်မှု ကောင်းမွန်ပါသည်။ဖီနော၊ ကလိုရိုဖောင်နှင့် အခြားအဆိပ်သင့်ဓာတ်ပစ္စည်းများ မလိုအပ်ပါ၊ နှင့် အီသနောမိုးရွာသွန်းမှုအဆင့်လည်း မဟုတ်ပါ။ဤကိရိယာကို ထုတ်ယူမှုနှုန်း 80% -90% ဖြင့် သန့်စင်သော high-copy plasmid DNA ၏ 0.2 -1.5 mg ကို လျင်မြန်စွာ ထုတ်ယူရန်အတွက် အသုံးပြုနိုင်သည်။ပစ္စည်းကိရိယာသည် endotoxin ကိုဖယ်ရှားပေးသည့်ထူးခြားသောလုပ်ငန်းစဉ်ဖော်မြူလာကိုအသုံးပြုသည်၊ endotoxin ၏ပါဝင်မှုအလွန်နိမ့်ပါးပြီးဆဲလ်ကူးစက်မှုအကျိုးသက်ရောက်မှုအလွန်ကောင်းမွန်သည်။ထုတ်ယူထားသော ပလတ်စမစ်ကို အင်ဇိုင်းအစာခြေခြင်း၊ PCR၊ in vitro transcription၊ transformation၊ sequencing နှင့် အခြားသော မော်လီကျူးဇီဝဗေဒစမ်းသပ်မှုများတွင် တိုက်ရိုက်အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။
သိုလှောင်မှုအခြေအနေများ
RNaseA ကို -30 ~ -15 ℃ တွင် သိမ်းဆည်းပြီး ≤ 0 ℃ တွင် သယ်ဆောင်သင့်သည်။
Endotoxin Scavenger ကို 2 ~ 8 ℃ တွင် တစ်လကြာ သိမ်းဆည်းနိုင်ပြီး - 30 ~ -15 ℃ တွင် ရေရှည်သိမ်းဆည်းနိုင်သည် ။နှင့် ≤0 ℃ တွင် ပို့ဆောင်ပေးသည်။
အခြားအစိတ်အပိုင်းများကို အခန်းအပူချိန် (15 ~ 25 ℃) တွင် သိမ်းဆည်းပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် သယ်ဆောင်သင့်ပါသည်။
အစိတ်အပိုင်းများ
| အစိတ်အပိုင်းများ | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| ကြားခံ P1 | 75 ml |
| ကြားခံ P2 | 75 ml |
| Buffer P4 | 75 ml |
| Endotoxin Scavenger | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| ကြားခံတီဘီ | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi ကော်လံများ (50ml စုဆောင်းမှု Tube တွင် တစ်ခုစီ) | 10 |
| Endotoxin ကင်းစင်သော စုဆောင်းမှုပြွန် | ၂ × ၅ |
RNaseA-10 mg/ml၊ RNA ကိုဖယ်ရှားရန်အသုံးပြုသည်။
ကြားခံ P1-ဘက်တီးရီးယားဆိုင်းထိန်းကြားခံ၊ ပထမအသုံးမပြုမီ Buffer P1 သို့ RNaseA ထည့်ပါ။
ကြားခံ P2-ဘက်တီးရီးယား lysis ကြားခံ (SDS/NaOH ပါ၀င်သည်)။
Buffer P4-neutralizing ကြားခံ။
Endotoxin Scavenger:plasmid ထုတ်ယူမှုမှ endotoxin ကိုထိရောက်စွာဖယ်ရှားပါ။
ကြားခံ PW-ပထမအသုံးမပြုမီ ကြားခံဆေးကြောပါ၊ သတ်မှတ်သော အီသနောပမာဏကို ထည့်ပါ။
ကြားခံတီဘီ-elution ကြားခံ။
FastPure DNA Maxi ကော်လံများ-plasmid DNA စုပ်ယူမှုကော်လံများ။
Collection Tubes 50 ml-filtrate စုဆောင်းမှုပြွန်။
Endotoxin ကင်းစင်သော စုဆောင်းမှုပြွန်-plasmid DNA စုဆောင်းမှုပြွန်များ။
ပြင်ဆင်ထားသည့်ပစ္စည်းများ
အကြွင်းမဲ့ အီသနော၊ အိုင်ဆိုပရောပနော၊ 50 မီလီလီတာ အဝိုင်းအောက်ခြေ အာရုံခံပြွန်များနှင့် 50 မီလီလီတာ endotoxin ကင်းစင်သည်။centrifuge ပြွန်များ။
လျှောက်လွှာများ
ဤထုတ်ကုန်သည် ဘက်တီးရီးယားဖြေရှင်းချက် 150 မှ 300 ml မှ ပလတ်စမစ်များကို အကြီးစားထုတ်ယူရန်အတွက် သင့်လျော်သည်။နေ့ချင်းညချင်း ယဉ်ကျေးတယ်။
စမ်းသပ်မှု လုပ်ငန်းစဉ်
1. 150 – 200 ml (300 ml ထက် မပို) ကို တစ်ညလုံး မွေးမြူထားသော ဘက်တီးရီးယား ပိုးသတ်ဆေးရည်ကို သောက်ပြီး centrifuge နေရာတွင် ထားပါ။11,000 rpm (12,000 × g) ခန့် 1-2 မိနစ်။အပေါ်ယံကို စွန့်ပစ်ပြီး ဘက်တီးရီးယားတွေကို စုဆောင်းပါ။
Δ ဘက်တီးရီးယား 50 ml ထက်ပို၍ စုဆောင်းသောအခါ၊ ဘက်တီးရီးယားပျော်ရည်ကို ပေါင်းထည့်ခြင်း၊ centrifugation၊ supernatant နှင့် အခြားအဆင့်များကို တူညီသော 50 ml ပြွန်တွင် စွန့်ပစ်ခြင်းဖြင့် ဘက်တီးရီးယားများကို စုဆောင်းနိုင်ပါသည်။
အကြိမ်များစွာ။
2. Buffer P1 ၏ 7.5 ml ကို ပေါင်းထည့်ပါ (ကျေးဇူးပြု၍ RNaseA ကို Buffer P1 သို့ ထည့်ထားခြင်း ရှိမရှိ စစ်ဆေးပါ) centrifuge သို့ ၊ဘက်တီးရီးယားများပါရှိသော ပြွန်ကို ရေဝဲ သို့မဟုတ် ပိုက်ဖြင့် သေချာရောမွှေပါ။
Δ ဤအဆင့်ရှိ ဘက်တီးရီးယားများ၏ ပြီးပြည့်စုံသော ပြန်လည်ရှင်သန်မှုသည် အထွက်နှုန်းအတွက် အရေးကြီးပြီး ပြန်လည်စတင်ပြီးနောက်တွင် ဘက်တီးရီးယားအဖုအထစ်များ မရှိသင့်ပါ။နှံ့စပ်မှုမရှိသော ဘက်တီးရီးယားအစုအဝေးများရှိနေပါက အထွက်နှုန်းနည်းပြီး သန့်စင်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး lysis ကို ထိခိုက်စေပါသည်။ဘက်တီးရီးယားပျော်ရည်၏ OD600 သည် 0.65 ဖြစ်ပါက Buffer P1 ၏ 7.5 ml ကို ဘက်တီးရီးယားပျော်ရည် 150 ml မှထုတ်ယူသည့်အခါ အသုံးပြုရန် အကြံပြုထားသည်။OD600 သည် 0.75 ဖြစ်သောအခါ၊ Buffer P1 ၏ 8 ml ကို အသုံးပြုသင့်ပြီး Buffers P2 နှင့် P4 ၏ ပမာဏများကို အလိုက်သင့် ပြောင်းလဲသင့်ပါသည်။ဘက်တီးရီးယားပျော်ရည်၏ ပမာဏကို 200 ml သို့တိုးပါက၊ အကြံပြုထားသည်။Buffers P1, P2, နှင့် P4 ၏ ထုထည်ပမာဏကို အချိုးကျ တိုးစေပါသည်။
3. အဆင့် 2 မှ Buffer P2 ၏ 7.5 ml ကို ဘက်တီးရီးယား ဆိုင်းထိန်းစနစ်ထဲသို့ ထည့်ပြီး 6 မှ 8 အထိ ညင်သာစွာ ရောမွှေပါ။အကြိမ်ရေ ၄-၅ မိနစ်ခန့် အခန်းအပူချိန်တွင် မွှေပေးပါ။
∆ နှံ့စပ်အောင်ရောမွှေပြီး ညင်သာစွာပြောင်းလိုက်ပါ။Vortexing သည် မျိုးဗီဇ DNA အကွဲအပြဲများကို ဖြစ်စေပြီး ထုတ်ယူထားသော ပလာစမစ်တွင် မျိုးဗီဇ DNA အပိုင်းအစများ ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ဤအချိန်တွင်၊ ဖြေရှင်းချက်သည် ပျစ်လာပြီး ကြည်လင်လာကာ ဘက်တီးရီးယားများကို အပြည့်အဝ lysed ကြောင်းပြသသည်။ပလတ်စမစ်များ မပျက်စီးစေရန် ကြာချိန်သည် 5 မိနစ်ထက် မပိုသင့်ပါ။ဖြေရှင်းချက် မရှင်းလင်းပါက ဘက်တီးရီးယားများ အများအပြားထွက်ရှိနိုင်သည်။မပြည့်စုံသော lysis ဖြစ်သောကြောင့် ဘက်တီးရီးယားပမာဏကို သင့်လျော်စွာ လျှော့ချသင့်သည်။
4. Buffer P4 ၏ 7.5 ml ကို အဆင့် 3 မှ ဘက်တီးရီးယား ဆိုင်းငံ့မှုသို့ ထည့်ပြီး အဖြေကို Buffer P2 အပြည့်အဝ ပျက်ပြယ်စေရန် ခွင့်ပြုရန် ချက်ချင်း 6-8 ကြိမ် ညင်သာစွာ ပြောင်းပြန်ပါ။ဤအချိန်တွင် အဖြူရောင် flocculent precipitate ပေါ်လာသင့်သည်။11,000 rpm (12,000 × g) ထက် 10 မိနစ်မှ 15 မိနစ်အထိ centrifuge သည် supernatant ကို 50 ml အောက်ခြေ centrifuge tube အသစ် (ကိုယ်တိုင်ပြင်ဆင်ထားသည်) သို့ ဂရုတစိုက် ပိုက်ထည့်ကာ ရှောင်ရှားပါ။မျောနေသော အဖြူရောင်မိုးရေကို စုပ်ယူပါ။
Δ Buffer P4 ကိုထည့်ပြီး ကောင်းစွာရောမွှေရန် ချက်ချင်းပြောင်းပြန်ပါ။မိုးရွာသွန်းမှုကို ထိခိုက်စေနိုင်သည့် ဒေသန္တရမိုးရွာသွန်းမှုကို ဟန့်တားရန်အတွက် အဖြူရောင်မိုးရေများ အညီအမျှ ဖြန့်ဝေသည်အထိ ပြွန်ကို ထားထားပါ။centrifugation မလုပ်မီ တူညီသော အဖြူရောင် flocculent precipitate မရှိ၍ centrifugation ပြီးနောက် supernatant သည် မရှင်းလင်းပါက၊ tube ဖြစ်နိုင်သည်၊နောက်ထပ် 5 မိနစ်အတွက် centrifuged ။
5. Endotoxin Scavenger ၏ 0. 1 ကြိမ် (supernatant ထုထည်၏ 10%၊ 2.2 ml) ခန့်ကို အဆင့် 4 မှ supernatant သို့ ရောမွှေပါ။ဖျော်ရည်ကို ရေခဲရေချိုးခန်းထဲတွင် ထားပါ သို့မဟုတ် ကြေသွားအောင် ရေခဲသေတ္တာ (သို့မဟုတ် ရေခဲသေတ္တာ) တွင် ၅ မိနစ်ကြာ ပေါင်းထည့်ကာ အမှုန်အမွှားအဖြစ်မှ ကြည်လင်ပြီး ဖောက်ထွင်းမြင်နိုင်သည် (သို့မဟုတ် ဆက်လက်၍)အနည်းငယ် turbid) နှင့် ရံဖန်ရံခါ အကြိမ်များစွာ ရောမွှေပါ။
Δ Endotoxin Scavenger ကို supernatant ထဲသို့ ပေါင်းထည့်ပြီးနောက်၊ supernatant သည် ပျော့ပျောင်းလာသော်လည်း၊ရေခဲရေချိုးခန်းထဲမှာ အအေးခံပြီးရင် supernatant ဟာ ကြည်လင်ပြီး (ဒါမှမဟုတ် အနည်းငယ် turist) ဖြစ်သင့်တယ်။
6. supernatant ကို အခန်းအပူချိန် (>25 ℃) တွင် 10 – 15 မိနစ်ကြာထားပြီးနောက်၊၎င်း၏အပူချိန်သည် အခန်းအပူချိန်သို့ တိုးလာသည်။ထို့နောက် supernatant ကို ရောနှောရန် ပြောင်းပြန်လှန်သင့်သည်။
Δ အခန်းအပူချိန် နိမ့်နေပါက သို့မဟုတ် ထုတ်ယူချိန်ကို လျှော့ချလိုပါက 37 ~ 42 ℃ ရေချိုးခန်းတွင် 5 မိနစ်မှ 10 မိနစ်ကြာ ပေါက်ဖွားနိုင်ပြီး supernatant ပြီးနောက် နောက်တစ်ဆင့်ကို လုပ်ဆောင်နိုင်ပါသည်။turbid ဖြစ်လာသည်။
7. အဆင့်ခွဲခြားရန် အခန်းအပူချိန်တွင် 11,000 rpm (12,000 × g) တွင် supernatant အား အာရုံစူးစိုက်မှုပြုလုပ်ပါ။အပေါ်ဘက်တွင် ရေ၀င်သောအဆင့်တွင် DNA ပါရှိပြီး အောက်အပြာရောင်အဆီပြန်သည့်အလွှာတွင် endotoxin နှင့် အခြားအညစ်အကြေးများပါရှိသည်။လွှဲပြောင်းပါ။DNA ပါဝင်သော aqueous အဆင့်သည် ပြွန်အသစ်ဆီသို့ လည်းကောင်း၊အဆီပြန်တဲ့အလွှာကို ဖယ်လိုက်ပါ။
Δ ထိရောက်သောအဆင့်ခွဲခြားခြင်းမပြုသောကြောင့် centrifugation လုပ်စဉ်အပူချိန်သည် 25 ℃ကျော်ဖြစ်ရမည်။အပူချိန် အရမ်းနိမ့်ရင် ဖြစ်တတ်ပါတယ်။
∆ အဆင့်ခွဲခြားခြင်း မထိရောက်ပါက၊ centrifugation temperature ကို 30 ℃ နှင့် ချိန်ညှိနိုင်သည်။centrifugation ၏အချိန်ကို 15 မိနစ်အထိတိုးမြှင့်နိုင်သည်။
Δ Endotoxin နှင့် အခြားသော အညစ်အကြေးများ ပါဝင်သောကြောင့် အပြာရောင်အဆီပြန်သောအလွှာကို မစုပ်ပါနှင့်။
ယန္တရား
Resuspension Lysis Neutralization
◇ 7.5 ml Buffer P1 ကိုထည့်ပါ။
◇ 7.5 ml Buffer P2 ကိုထည့်ပါ။
◇ 7.5 ml Buffer P4 ကိုထည့်ပါ။
Endotoxin ဖယ်ရှားခြင်း။
◇ 0. Endotoxin Scavenger ၏ supernatant ပမာဏ 1 ကြိမ်ထည့်ပါ။
ချည်နှောင်ပြီး ဆေးကြောခြင်း။
◇ isopropanol ပမာဏ 0.5 ဆ ထည့်ပါ။
◇ 10 ml Buffer PW ထည့်ပါ။
◇ 10 ml Buffer PW ထည့်ပါ။
Elution
◇ 1 – 2 ml Buffer TB သို့မဟုတ် Endotoxin-free ddH2O ထည့်ပါ။
