Vaccinia Virus Capping Enzyme

Vaccinia virus capping enzyme သည် Vaccinia capping enzyme အတွက် မျိုးဗီဇများကို သယ်ဆောင်သည့် recombinant E. coli မျိုးဗီဇမှ ဆင်းသက်လာသည်။ဤအင်ဇိုင်းတစ်ခုတည်းသည် ယူနစ်နှစ်ခု (D1 နှင့် D12) ဖြင့်ဖွဲ့စည်းထားပြီး အင်ဇိုင်းလုပ်ဆောင်ချက်သုံးခု (D1 subunit မှ RNA triphosphatase နှင့် guanylyltransferase နှင့် D12 subunit မှ guanine methyltransferase) တို့ပါဝင်သည်။Vaccinia virus Capping Enzyme သည် 7-methylguanylate cap structure (m7Gppp, Cap 0) ကို RNA ၏ 5′ အဆုံးတွင် အတိအကျ ချိတ်တွဲပေးနိုင်သော ဦးထုပ်ဖွဲ့စည်းပုံဖွဲ့စည်းပုံကို ဓါတ်ပြုရန် ထိရောက်မှုရှိပါသည်။ဦးထုပ်ဖွဲ့စည်းပုံ (Cap 0) သည် eukaryotes တွင် mRNA တည်ငြိမ်ခြင်း၊ သယ်ယူပို့ဆောင်ခြင်းနှင့် ဘာသာပြန်ခြင်းတွင် အရေးကြီးသောအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ပါသည်။အင်ဇိုင်းတုံ့ပြန်မှုဖြင့် RNA ကို ကန့်သတ်ခြင်းသည် ထိရောက်ပြီး ရိုးရှင်းသောနည်းလမ်းဖြစ်ပြီး ဗီတိုရိုက်ခြင်း၊ Transfection နှင့် microinjection အတွက် RNA ၏ တည်ငြိမ်မှုနှင့် ဘာသာပြန်ဆိုခြင်းတို့ကို သိသိသာသာ တိုးတက်ကောင်းမွန်စေသည့် ထိရောက်ပြီး ရိုးရှင်းသောနည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။

အစိတ်အပိုင်းများ

Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)

10× Capping Buffer

သိုလှောင်မှုအခြေအနေများ

သိုလှောင်မှုအတွက် -25～-15 ℃ (ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲသွားသောစက်များကို ရှောင်ပါ)

သိုလှောင်မှုကြားခံ

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl၊

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol။

ယူနစ်အဓိပ္ပါယ်

Vaccinia virus Capping Enzyme တစ်ယူနစ်ကို အပူချိန် 37°C တွင် 1 နာရီအတွင်း 10pmol ၏ GTP ၏ 80nt မှတ်တမ်းအဖြစ် ပေါင်းစည်းရန် လိုအပ်သော အင်ဇိုင်းပမာဏအဖြစ် သတ်မှတ်သည်။

အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု

Exonuclease-1μg λ-Hind III ပါ၀င်သော Vaccinia virus Capping Enzyme ၏ 10U သည် DNA ကို 37 ℃ တွင် 16 နာရီကြာ ချေဖျက်နိုင်ပြီး agarose gel electrophoresis မှသတ်မှတ်ထားသည့်အတိုင်း ပြိုကွဲခြင်းမရှိပါ။

Endonuclease-10U of Vaccinia virus Capping Enzyme သည် 37 ℃ တွင် 37 ℃ တွင် 16 နာရီကြာ agarose gel electrophoresis မှသတ်မှတ်ထားသည့်အတိုင်း ပြိုကွဲခြင်းမရှိပါ။

Nickase-10U of Vaccinia virus Capping Enzyme သည် 37 ℃ တွင် 1 μg pBR322 ပါသော 16 နာရီကြာ agarose gel electrophoresis မှသတ်မှတ်ထားသည့်အတိုင်းပြိုကွဲခြင်းမရှိပါ။

RNase-10U of Vaccinia virus Capping Enzyme သည် 1.6μg MS2 RNA ပါ၀င်သော 37 ℃ တွင် 4 နာရီကြာ agarose gel electrophoresis မှသတ်မှတ်ထားသည့်အတိုင်း ပြိုကွဲခြင်းမရှိပါ။

1.coli DNAVaccinia virus Capping Enzyme ၏ 10U ကို TaqMan qPCR ဖြင့် E. coli 16S rRNA locus အတွက် သီးသန့် primers ဖြင့် E. coli genomic DNA ရှိနေခြင်းအတွက် စစ်ဆေးပါသည်။E. coli genomic DNA ညစ်ညမ်းမှုသည်≤1 E. coli genome ဖြစ်သည်။

2.ဘက်တီးရီးယား Endotoxin- LAL-test၊ Chinese Pharmacopoeia IV 2020 ထုတ်ဝေမှုအရ၊ ဂျယ်ကန့်သတ်စမ်းသပ်နည်းလမ်း၊ အထွေထွေစည်းမျဉ်း (1143) အရ။ဘက်တီးရီးယား endotoxin ပါဝင်မှုသည် ≤10 EU/mg ဖြစ်သင့်သည်။

တုံ့ပြန်မှုစနစ်နှင့် အခြေအနေများ

1. Capping Protocol (တုံ့ပြန်မှုပမာဏ- 20 μL)

ဤလုပ်ထုံးလုပ်နည်းသည် 10μg RNA (≥100 nt) ၏ တုံ့ပြန်မှုတွင် အကျုံးဝင်ပြီး ၎င်းကို စမ်းသပ်မှုတောင်းဆိုချက်များအရ အတိုင်းအတာအထိ ချဲ့နိုင်သည်။

၁) 10μg RNA နှင့် Nuclease-free H2O ကို 1.5 ml မိုက်ခရိုဖန်းပြွန်တစ်ခုတွင် 15.0 µL နောက်ဆုံးထုထည်အဖြစ် ပေါင်းစပ်ပါ။*10×Capping Buffer- 0.5M Tris-HCl၊ 50 mM KCl၊ 10 mM MgCl2၊ 10 mM DTT၊ (25 ℃၊ pH 8.0)

2) 65°C တွင် 5 မိနစ် အပူပေးပြီး ရေခဲရေချိုးပြီး 5 မိနစ်ခန့်ထားပါ။

3) သတ်မှတ်ထားသောအစီအစဥ်တွင်အောက်ပါအစိတ်အပိုင်းများကိုထည့်ပါ။

*10× Capping Buffer: 0.5 M Tris-HCl၊ 50 mM KCl၊ 10 mM MgCl2၊ 10 mM DTT၊ (25 ℃၊ pH8.0)

4) 37 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင်မိနစ် 30 ဖုတ်ပါ၊ RNA သည်ယခုအခါတွင်ဖုံးလွှမ်းသွားပြီးအောက်ပိုင်းအသုံးချပရိုဂရမ်များအတွက်အဆင်သင့်ဖြစ်နေပါပြီ။

2. 5′ terminal အညွှန်းတုံ့ပြန်မှု (တုံ့ပြန်မှုပမာဏ- 20 μL)

ဤပရိုတိုကောသည် 5´ triphosphate ပါရှိသော RNA ကို တံဆိပ်ကပ်ရန် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားပြီး လိုအပ်ချက်အရ အတိုင်းအတာအထိ ချဲ့နိုင်သည်။အညွှန်းပေါင်းစည်းခြင်း၏ ထိရောက်မှုသည် RNA: GTP ၏ molar ratio နှင့် RNA နမူနာများတွင် GTP ပါဝင်မှုများကြောင့် သက်ရောက်မှုရှိမည်ဖြစ်သည်။

1) သင့်လျော်သော RNA နှင့် Nuclease-free H2O ပမာဏကို 1.5 ml မိုက်ခရိုဖန်းပြွန်တစ်ခုတွင် နောက်ဆုံးပမာဏ 14.0 µL ပေါင်းစပ်ပါ။

2) 65°C တွင် 5 မိနစ် အပူပေးပြီး ရေခဲရေချိုးပြီး 5 မိနစ်ခန့်ထားပါ။

3) သတ်မှတ်ထားသောအစီအစဥ်တွင်အောက်ပါအစိတ်အပိုင်းများကိုထည့်ပါ။

** GTP MIX သည် GTP နှင့် အမှတ်အသား အနည်းငယ်ကို ရည်ညွှန်းသည်။GTP ၏အာရုံစူးစိုက်မှုအတွက်၊ ကိုးကားပါ။Note 3 သို့။

4) 37°C တွင် မိနစ် 30 ကြာ ဖုတ်ပါ၊ RNA 5′ နိဂုံးကို ယခု တံဆိပ်တပ်ထားပြီး မြစ်အောက်ပိုင်းအတွက် အဆင်သင့်ဖြစ်နေပါပြီ။

လျှောက်လွှာများ

1. ဘာသာပြန်ဆိုချက်များ/ဗီတိုဘာသာပြန်ခြင်းမပြုမီ mRNA ကို ကန့်သတ်ပါ။

2. mRNA ၏အဆုံး 5´ ကို တံဆိပ်တပ်ခြင်း။

အသုံးပြုမှုမှတ်စုများ

1.Vaccinia Capping Enzyme ဖြင့် ပေါက်ဖွားခြင်းမပြုမီ RNA ၏အဖြေကို အပူပေးခြင်းသည် စာသားမှတ်တမ်း၏ 5´အဆုံးရှိ ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံကို ဖယ်ရှားပေးသည်။လူသိများသော မြင့်မားသောဖွဲ့စည်းပုံ 5'ends ပါသော စာသားမှတ်တမ်းများအတွက် မိနစ် 60 သို့ အချိန်တိုးပါ။

2. ကန့်သတ်တုံ့ပြန်မှုများအတွက်အသုံးပြုသော RNA ကို အသုံးမပြုမီ သန့်စင်ပြီး နူကလီးယားကင်းစင်သောရေတွင် ဆိုင်းငံ့ထားသင့်သည်။EDTA မပါရှိသင့်ပါ၊ အဖြေသည် ဆားမပါရှိသင့်ပါ။

3. 5´ အဆုံးကို တံဆိပ်ကပ်ခြင်းအတွက်၊ စုစုပေါင်း GTP အာရုံစူးစိုက်မှုသည် တုံ့ပြန်မှုတွင် mRNA ၏အံသွားပြင်းအား 1-3 ဆခန့် ဖြစ်သင့်သည်။

4. တုံ့ပြန်မှုစနစ်၏ ထုထည်ပမာဏကို အမှန်တကယ် အတိုင်းအတာအရ အတက်/အဆင်း ပြုလုပ်နိုင်သည်။