PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) သည် glycoproteins မှ N-linked oligosaccharides အားလုံးနီးပါးကိုဖယ်ရှားရန်အတွက်အထိရောက်ဆုံးအင်ဇိုင်းနည်းလမ်းဖြစ်သည်။PNGase F သည် N-linked glycoproteins မှ မြင့်မားသော mannose၊ hybrid နှင့် ရှုပ်ထွေးသော oligosaccharides များ၏ အတွင်းစိတ်အကျဆုံး GlcNAc နှင့် asparagine အကြွင်းအကျန်များကြားတွင် ပိုင်းခြားထားသော amidase တစ်ခုဖြစ်သည်။
လျှောက်လွှာ
ဤအင်ဇိုင်းသည် ပရိုတင်းများမှ ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်အကြွင်းအကျန်များကို ဖယ်ရှားရန်အတွက် အသုံးဝင်သည်။
ပြင်ဆင်မှုနှင့် သတ်မှတ်ချက်
| အသွင်အပြင် | အရောင်မဲ့ အရည် |
| ပရိုတင်း သန့်စင်ခြင်း။ | ≥95% (SDS-PAGE မှ) |
| လုပ်ဆောင်ချက် | ≥500,000 U/ml |
| Exoglycosidase | မည်သည့်လုပ်ဆောင်ချက်ကိုမျှ ရှာမတွေ့နိုင်ပါ (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| ပရိုတင်း | ND |
သတ္တိ
| EC နံပါတ် | ၃.၅.၁.၅၂(သေးငယ်သောဇီဝသက်ရှိများမှ ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ခြင်း) |
| မော်လီကျူးအလေးချိန် | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelectric အမှတ် | ၈။ ၁၄ |
| အကောင်းဆုံး pH | ၇.၀-၈.၀ |
| အကောင်းဆုံးအပူချိန် | 65°C |
| Substrate တိကျမှု | GlcNAc နှင့် asparagine အကြွင်းအကျန်များကြားရှိ glycosidic နှောင်ကြိုးများကို ဖယ်ထုတ်ခြင်း Fig.1 |
| အသိဆိုက်များ | α1-3 fucose မပါ၀င်ပါက N-linked glycans များ |
| Activators များ | DTT |
| တားမြစ်သည်။ | SDS |
| သိုလှောင်မှုအပူချိန် | -25 ~-15 ℃ |
| အပူမလှုပ်ရှားခြင်း။ | PNGase F ၏ 1µL ပါရှိသော 20µL တုံ့ပြန်မှုအရောအနှောကို 75°C တွင် ပေါက်ဖွားခြင်းဖြင့် 10 မိနစ်ကြာ အသက်မသွင်းပါ။ |
ပုံ။ 1 PNGase F ၏ အလွှာဆိုင်ရာ တိကျမှု
ပုံ 2 Recognition သည် PNGase F ၏ နေရာဖြစ်သည်။
အတွင်း GlcNAc အကြွင်းအကျန်များကို α1-3 fucose နှင့် ချိတ်ဆက်သောအခါ၊ PNGase F သည် N-linked oligosaccharides များကို glycoproteins မှ မခွဲထုတ်နိုင်ပါ။ဤပြုပြင်မွမ်းမံမှုသည် အပင်များနှင့် အင်းဆက်အချို့တွင် glycoprotein များအဖြစ်များသည်။
Cအစိတ်အပိုင်းများ
|
| အစိတ်အပိုင်းများ | အာရုံစူးစိုက်မှု |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10× Glycoprotein ၏ဒြပ်မဲ့ Buffer | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer ၂ | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
ယူနစ် အဓိပ္ပါယ်
တစ်ယူနစ်(U) ကို 10 µL တွင် 37°C တွင် 1 နာရီအတွင်း 10 µg မှ denatured RNase B မှ ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်> 95% ကို ဖယ်ရှားရန် လိုအပ်သော အင်ဇိုင်းပမာဏအဖြစ် သတ်မှတ်သည်။
တုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများ
1. glycoprotein 1-20 µg ကို deionized water ဖြင့် ပျော်အောင် 1 µl 10 × Glycoprotein Denaturing Buffer နှင့် H2O (လိုအပ်ပါက) 10 µl စုစုပေါင်းတုံ့ပြန်မှုပမာဏပြုလုပ်ရန်။
2.100°C တွင် ၁၀ မိနစ်ခန့် ဖုတ်ပြီး ရေခဲပေါ်တွင် အအေးခံပါ။
3.2 µl 10 × GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 ထည့်ပြီး ရောမွှေပါ။
4.1-2 µl PNGase F နှင့် H ကိုထည့်ပါ။2O (လိုအပ်ပါက) စုစုပေါင်းတုံ့ပြန်မှုပမာဏ 20 µl ကိုပြုလုပ်၍ ရောမွှေပါ။
5.37°C တွင် တုံ့ပြန်မှုကို မိနစ် 60 ဖုတ်ပါ။
6.SDS-PAGE ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု သို့မဟုတ် HPLC ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်။
