mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase သည် ကာကွယ်ဆေးအတွက် mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase ဗီဇကိုသယ်ဆောင်သည့် ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသည့် E. coli မျိုးဗီဇမှ ဆင်းသက်လာသည်။ဤအင်ဇိုင်းသည် RNA ၏ 5´ အဆုံးရှိ ဦးထုပ်ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် ကပ်လျက် ကပ်လျက် ရှိသော ပထမနျူကလီးအိုတဒ်၏ 2´-O အနေအထားတွင် မီသိုင်းအုပ်စုကို ပေါင်းထည့်ပါသည်။ အဆိုပါ အင်ဇိုင်းသည် S-adenosylmethionine (SAM) ကို အသုံးပြု၍ မီသိုင်းလိတ်ကို ဖုံးအုပ်ထားသော RNA (ထုပ်) ရလဒ် -0) cap- 1 ဖွဲ့စည်းပုံ။

Cap1 ဖွဲ့စည်းပုံသည် transfection နှင့် microinjection စမ်းသပ်မှုများတွင် mRNA ၏ဖော်ပြမှုကို တိုးတက်စေပြီး ဘာသာပြန်စွမ်းရည်ကို တိုးမြှင့်ပေးနိုင်ပါသည်။ ဤအင်ဇိုင်းသည် အထူးအားဖြင့် m7GpppN cap ပါရှိသော RNA လိုအပ်ပါသည်။5´ အဆုံးတွင် pN၊ ppN၊ pppN သို့မဟုတ် GpppN ဖြင့် RNA ကို အသုံးမပြုနိုင်ပါ။Capped RNA ကို cap analog သုံးပြီး in vitro transcription မှတဆင့် သို့မဟုတ် Vaccinia Capping Enzyme ကို အသုံးပြု၍ အင်ဇိုင်းဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားနိုင်သည်။

အစိတ်အပိုင်းများ

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10× Capping Reaction Buffer

သိုလှောင်မှု

သိုလှောင်ရန်အတွက် -25～-15℃ (ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲသွားသောစက်များကို ရှောင်ပါ)

သိုလှောင်မှုကြားခံ

20 mM Tris-HCl (pH 8.0၊ 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol။

ယူနစ် အဓိပ္ပါယ်

တစ်ယူနစ်ကို 37°C တွင် 1 နာရီအတွင်း 80 nt capped RNA transcript ၏ methylate 10 pmoles လိုအပ်သော အင်ဇိုင်းပမာဏအဖြစ် သတ်မှတ်သည်။

အရည်အသွေးထိန်းချုပ်စစ်ဆေးမှုများ

Exonuclease:50U of mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase 1μg λ-Hind III သည် DNA ကို 37 ℃ တွင် 16 နာရီကြာ ချေဖျက်ပြီး agarose gel electrophoresis အရ ပြိုကွဲခြင်းမရှိပါ။

Endonuclease: mRNA Cap 2 ၏ 50 U ´ -O-Methyltransferase 1 μg λDNA ပါသော 37 ℃ တွင် 16 နာရီကြာ agarose gel electrophoresis မှသတ်မှတ်ထားသည့်အတိုင်း ပြိုကွဲခြင်းမရှိပါ။

Nickase: 50U of mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase 1μg pBR322 ပါသော 37 ℃ တွင် 16 နာရီကြာ agarose gel electrophoresis မှသတ်မှတ်ထားသည့်အတိုင်း ပြိုကွဲခြင်းမရှိပါ။

RNase: mRNA Cap 2 ၏ 50U ´ -O-Methyltransferase 1.6μg MS2 RNA ပါသော 37 ℃ တွင် 4 နာရီကြာ agarose gel electrophoresis အရ ပြိုကွဲခြင်းမရှိပါ။

E. coli DNAmRNA Cap 2 ၏ 50U ´ -O-Methyltransferase ပါဝင်မှုကို စစ်ဆေးသည်၊E. coli TaqMan qPCR ကို အသုံးပြု၍ မျိုးရိုးဗီဇ DNA သည် ၎င်းအတွက် သီးသန့်ဖြစ်သည်။E. coli 16S rRNA နေရာ။ဟိE. coli မျိုးဗီဇ DNA ညစ်ညမ်းမှုသည် = ၁E. coli ဂျီနိုအာ။

ဘက်တီးရီးယား Endotoxin- LAL-test၊ Chinese Pharmacopoeia IV 2020 ထုတ်ဝေမှုအရ၊ ဂျယ်ကန့်သတ်စမ်းသပ်နည်းလမ်း၊ အထွေထွေစည်းမျဉ်း (1143)။ဘက်တီးရီးယား endotoxin ပါဝင်မှုသည် = 10 EU/mg ဖြစ်သင့်သည်။

တုံ့ပြန်မှုစနစ်နှင့် အခြေအနေများ

1. Capped RNA နှင့် RNase-free H2O ကို 1.5 mL မိုက်ခရိုဖိုပြွန်တစ်ခုတွင် သင့်လျော်သောပမာဏကို 16.0 µL ဖြင့် ပေါင်းစပ်ပါ။

2. 65 ℃ ဖြင့် 5 မိနစ် အပူပေးပြီး ရေခဲရေချိုးပြီး 5 မိနစ် ထားပါ။

3. သတ်မှတ်ထားသော အစီအစဥ်တွင် အောက်ဖော်ပြပါ အစိတ်အပိုင်းများကို ပေါင်းထည့်ပါ ( Capped RNA ၏ မီသိုင်းရှင်းခြင်းအတွက်

10 အောက်

*10× Capping Reaction Buffer : 500 mM Tris-HCl(pH 8.0၊ 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT

4. အပူချိန် 37 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် 1 နာရီကြာ (200 nt ထက်နည်းသော ပစ်မှတ်အပိုင်းအတွက် 2 နာရီကြာ ပေါက်ဖွားရန် အကြံပြုထားသည်)။

လျှောက်လွှာများ

microinjection နှင့် transfection စမ်းသပ်မှုများအတွင်း mRNA ဖော်ပြမှုကို တိုးတက်စေရန်။

အသုံးပြုမှုမှတ်စုများ

1. တုံ့ပြန်မှုမပြုမီ၊ RNA သည် နျူကလီးယားကင်းစင်သောရေတွင် သန့်စင်ပြီး ပျော်ဝင်သင့်သည်၊ ဖြေရှင်းချက်အားလုံးတွင် EDTA နှင့် အိုင်းယွန်းမပါဝင်သင့်ပါ။

2. စာသားမှတ်တမ်း၏ 5´အဆုံးတွင် ဆင့်ပွားဖွဲ့စည်းပုံကို ဖယ်ရှားရန် တုံ့ပြန်မှုမပြုမီ 65 ℃ တွင် နမူနာ RNA ကို 5 မိနစ်အပူပေးရန် အကြံပြုထားသည်။ရှုပ်ထွေးသော 5´-terminal ဖွဲ့စည်းပုံအတွက် ၎င်းကို 10 မိနစ်အထိ တိုးမြှင့်နိုင်သည်။