Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA KIT

ဤကိရိယာသည် စည်းမျဥ်းကိုမခွဲခြားဘဲ အခြေခံအတွဲ(bp) 60 အထက်ရှိသော dsRNA ၏အရှည်ပမာဏကိုတိုင်းတာရန်အတွက် biotin-Streptavidin စနစ်နှင့် Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ချိတ်ဆက်မှုတစ်ခုဖြစ်သည်။ပန်းကန်ပြားအား anti-dsRNA ပဋိပစ္စည်းဖြင့် ကြိုတင်ဖုံးအုပ်ထားသည်။နမူနာတွင်ပါရှိသော dsRNA ကို ပေါင်းထည့်ပြီး ရေတွင်းများပေါ်တွင် ဖုံးအုပ်ထားသော ပဋိပစ္စည်းများနှင့် ချည်နှောင်ထားသည်။ထို့နောက်တွင် biotinylated anti-dsRNA ပဋိပစ္စည်းကို ပေါင်းထည့်ကာ နမူနာတွင် dsRNA နှင့် ချည်နှောင်သည်။ဆေးကြောပြီးနောက်၊ HRP-Streptavidin ကို ပေါင်းထည့်ကာ Biotinylated anti-dsRNA ပဋိပစ္စည်းနှင့် ချည်နှောင်ထားသည်။ပေါက်ဖွားပြီးနောက် HRP-Streptavidin ကို ဆေးကြောပါ။ထို့နောက် အက်စစ်ဓာတ် ရပ်တန့်သည့် အဖြေကို ပေါင်းထည့်ပြီးနောက် အဝါရောင်သို့ ပြောင်းလဲသွားသော အပြာရောင် ထုတ်ကုန်ကို ထုတ်လုပ်ရန် TMB ဆပ်ပြာရည်ကို HRP မှ ဓာတ်ကူပေးပါသည်။အဝါရောင်၏သိပ်သည်းဆသည် ပန်းကန်ပြားတွင်ဖမ်းယူထားသော ပစ်မှတ်ပမာဏနှင့် အချိုးကျပါသည်။စုပ်ယူမှုကို 450 nm တွင်တိုင်းတာသည်။

လျှောက်လွှာ

ဤကိရိယာသည် ကျန်ရှိသော dsRNA ၏ အရေအတွက်တိုင်းတာခြင်းအတွက်ဖြစ်သည်။

Kit အစိတ်အပိုင်းများ

သိုလှောင်မှုနှင့် တည်ငြိမ်မှု

1. အသုံးမပြုသောကိရိယာအတွက်- ကိရိယာတစ်ခုလုံးကို သိုလှောင်မှုသက်တမ်းတွင် 2 ~ 8 ℃ တွင် သိမ်းဆည်းထားနိုင်သည်။သိုလှောင်မှုတည်ငြိမ်မှုအတွက် ပြင်းထန်သောအလင်းရောင်ကို ရှောင်ရှားသင့်သည်။

2. အသုံးပြုထားသောအစုံအလင်အတွက်- မိုက်ခရိုပလိတ်ကိုဖွင့်ပြီးသည်နှင့် အသုံးမပြုသောရေတွင်းများကို ပန်းကန်ပြားတံဆိပ်ခတ်စက်ဖြင့် ဖုံးအုပ်ပြီး သတ္တုရည်အိတ်ပါရှိသော သတ္တုပါးအိတ်ထဲသို့ ပြန်သွားကာ သတ္တုပြားအိတ်ကို ဇစ်ပိတ်ပြီး အသုံးပြုပြီးနောက် တတ်နိုင်သမျှ 2 ~ 8 ℃ သို့ ပြန်သွားပါ။အခြား ဓါတ်ပစ္စည်းများကို အသုံးပြုပြီးနောက် တတ်နိုင်သမျှ 2 ~ 8 ℃ သို့ ပြန်သွားသင့်သည်။

ပစ္စည်းများ လိုအပ်သော်လည်း မထောက်ပံ့ပေးပါ။

1. 450±10nm စစ်ထုတ်မှုပါရှိသော မိုက်ခရိုပလိတ်ဖတ်သူ (လှိုင်းအလျား 450 နှင့် 650 nm တွင် သိရှိနိုင်လျှင် ပိုကောင်းသည်)။

2. Microplate shaker ။

3. RNase-free အကြံပြုချက်များနှင့် centrifuge ပြွန်များ။

လည်ပတ်မှုပုံစံဇယား

သင်မစတင်မီ

1. အသုံးမပြုမီ ကိရိယာအစိတ်အပိုင်းများနှင့် နမူနာများအားလုံးကို အခန်းအပူချိန် (18-25 ℃) သို့ ယူဆောင်လာပါ။အစုံအလင်ကို တစ်ကြိမ်တွင် အသုံးမပြုပါက၊ လက်ရှိစမ်းသပ်ချက်အတွက် ကန့်လန့်ကာများနှင့် ဓာတ်ပစ္စည်းများကိုသာ ဖယ်ထုတ်ပြီး ကျန်ရှိသော အစင်းကြောင်းများနှင့် ဓာတ်ပစ္စည်းများကို လိုအပ်သည့်အခြေအနေတွင် ထားလိုက်ပါ။

2. Wash buffer- 1× wash buffer ၏ 800mL ကို ပြင်ဆင်ရန်အတွက် 760mL of deionized သို့မဟုတ် ပေါင်းခံရေနှင့် 20× စုစည်းထားသော လျှော်ကြားခံ 40mL ကို ဖျန်းပေးပါ။

3. စံသတ်မှတ်ချက်- အသုံးမပြုမီ စတော့ရှယ်ယာဖြေရှင်းချက်ကို ခေတ္တမျှလှည့်ပတ် သို့မဟုတ် ဗဟိုပြုပါ။ပေးထားသောစံနှုန်းလေးခု၏အာရုံစူးစိုက်မှုသည် 5ng/μL ဖြစ်သည်။UTP နှင့် pUTP dsRNA စံနှုန်းများအတွက်၊ စံမျဉ်းကွေးကိုဆွဲရန် STE ကြားခံဖြင့် 1,0.5,0.25,0.125,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL သို့ ကျေးဇူးပြု၍ ကျေးဇူးပြု၍ စတော့ရှယ်ယာဖြေရှင်းချက်အား ပျော့ပြောင်းပါ။N1-Me-pUTP dsRNA စံနှုန်းများအတွက်၊ ကျေးဇူးပြု၍ စံမျဉ်းကွေးကိုဆွဲရန် စတော့ရှယ်ယာဖြေရှင်းချက်အား 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL၊ STE ကြားခံကြားခံဖြင့် ကျေးဇူးပြု၍ ဖြန်းပေးပါ။5-OMe-UTP dsRNA စံနှုန်းအတွက်၊ ကျေးဇူးပြု၍ စံမျဉ်းကွေးကိုဆွဲရန် စတော့ရှယ်ယာဖြေရှင်းချက်ကို 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL သို့ STE ကြားခံဖြင့် ဖြန်းပေးပါ။စံချိန်စံညွှန်းများကို အောက်ပါဇယားများအတိုင်း မှေးမှိန်နိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ အကြံပြုအပ်ပါသည်။

4. Biotinylated detection antibody နှင့် HRP-streptavidin အလုပ်လုပ်သည့်ဖြေရှင်းချက်- အသုံးမပြုမီ စတော့ရှယ်ယာဖြေရှင်းချက်ကို ခေတ္တလှည့်ပတ် သို့မဟုတ် အာရုံစူးစိုက်မှုပြုလုပ်ပါ။၎င်းတို့ကို dilution buffer ဖြင့် လုပ်ဆောင်နေသော အာရုံစူးစိုက်မှုသို့ ပျော့သွားပါ။

5. TMB substate- ပိုးသတ်ထားသော အကြံပြုချက်များဖြင့် လိုအပ်သော ဆေးပမာဏကို စုပ်ယူပြီး ကျန်ရှိသော အရည်ကို ပုလင်းထဲသို့ ထပ်မံမစွန့်ပစ်ပါနှင့်။TMB အလွှာသည် အလင်းတွင် အာရုံခံနိုင်သည်၊ TMB အလွှာကို အချိန်အကြာကြီး အလင်းရောင်နှင့် မထိတွေ့ပါနှင့်။

ပရိုတိုကောကို အသုံးပြုခြင်း။

1. စစ်ဆေးမှုအတွက် လိုအပ်သော strips အရေအတွက်ကို သတ်မှတ်ပါ။အသုံးပြုရန်အတွက် ဘောင်များအတွင်း မျဉ်းကြောင်းများထည့်ပါ။ဤစစ်ဆေးမှုတွင် အသုံးမပြုသော လက်ကျန်ပန်းကန်ပြားများကို အိတ်ထဲတွင် ချောဆီစင်ဖြင့် ပြန်လည်ထုပ်ပိုးသင့်သည်။အအေးခန်းသိုလှောင်ရန်အတွက် အိတ်ကို တင်းကျပ်စွာပိတ်ပါ။

2. 100μL စံ၊ ဗလာနှင့် နမူနာများကို သင့်လျော်သောရေတွင်းထဲသို့ ပေါင်းထည့်ပါ။ပန်းကန်ဆေးစက်ဖြင့် ဖုံးအုပ်ပါ။500rpm ဖြင့် လှုပ်ခါပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် ၁ နာရီ ဖုတ်ပါ။နမူနာများကို တိကျသောစစ်ဆေးမှုအတွက် သင့်လျော်သောအာရုံစူးစိုက်မှုရရှိရန် STE ကြားခံဖြင့် ရောချသင့်သည်။

3. ရေဆေးသည့်အဆင့်- ဖြေရှင်းချက်ကို စွန့်ထုတ်ပြီး ရေတွင်းတစ်ခုစီသို့ 250μL ဆေးကြားခံဖြင့် ဆေးကြောပြီး 30 နှစ်ကြာအောင်ထားပါ။ပန်းကန်ပြားကို စုပ်ယူထားသော စက္ကူပေါ်သို့ ဆွဲယူခြင်းဖြင့် ဆေးကြားခံကို လုံးဝစွန့်ပစ်ပါ။လုံးဝ 4 ကြိမ်ဆေးပါ။

4. ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် biotinylated detection antibody အလုပ်လုပ်သည့်ဖြေရှင်းချက် 100μL ကိုထည့်ပါ။ပန်းကန်ဆေးစက်ဖြင့် ဖုံးအုပ်ပါ။500rpm ဖြင့် လှုပ်ခါပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် ၁ နာရီ ဖုတ်ပါ။

5. ရေဆေးတဲ့အဆင့်ကို ပြန်လုပ်ပါ။

6. ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် HRP-streptavidin အလုပ်လုပ်သည့်ဖြေရှင်းချက် 100μL ကိုထည့်ပါ။ပန်းကန်ဆေးစက်ဖြင့် ဖုံးအုပ်ပါ။500rpm ဖြင့် လှုပ်ခါပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် မိနစ် 30 ဖုတ်ပါ။

7. ရေဆေးတဲ့အဆင့်ကို တစ်ဖန်ပြန်လုပ်ပါ။

8. ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် TMB ဆပ်ပြာရည် 100μL ကိုထည့်ပါ။ပန်းကန်ဆေးစက်ဖြင့် ဖုံးအုပ်ပါ။RT တွင် မိနစ် 30 ကြာ အလင်းရောင်မှ ကာကွယ်ပါ။ဆပ်ပြာရည်ထည့်ခြင်းဖြင့် အရည်သည် ပြာသွားလိမ့်မည်။

9. ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် ရပ်တန့်ဖြေရှင်းချက် 50μL ကိုထည့်ပါ။Stop solution ပေါင်းထည့်ခြင်းဖြင့် အရည်သည် အဝါရောင်ပြောင်းသွားပါမည်။ထို့နောက် microplate reader ကို run ပြီး 450nm ဖြင့် တိုင်းတာမှုကို ချက်ချင်းလုပ်ဆောင်ပါ။

ရလဒ်များတွက်ချက်ခြင်း။

1. စံနှုန်းတစ်ခုစီအတွက်၊ ထိန်းချုပ်မှု၊ နှင့်နမူနာတစ်ခုစီအတွက် ပွားနေသောဖတ်ရှုမှုများကို ပျမ်းမျှအားဖြင့် ပျမ်းမျှ သုညစံ optical သိပ်သည်းဆကို နုတ်ပါ။ဒေါင်လိုက်(Y) ဝင်ရိုးပေါ်တွင် စုပ်ယူမှုနှင့် အလျားလိုက်(X)ဝင်ရိုးပေါ်တွင် dsRNA အာရုံစူးစိုက်မှုဖြင့် စံမျဉ်းကွေးတစ်ခုကို တည်ဆောက်ပါ။

2. မျဉ်းကွေးကျွမ်းကျင်သူ 1.3 သို့မဟုတ် ELISA Calc ကဲ့သို့သော ကွန်ပြူတာအခြေခံမျဉ်းကွေး-အံဝင်ခွင်ကျဆော့ဖ်ဝဲဖြင့် တွက်ချက်မှုကို 5 သို့မဟုတ် 4 ကန့်သတ်ဘောင်အတွင်း မျဉ်းဖြောင့်မဟုတ်သောပုံစံတွင် လုပ်ဆောင်ရန် အကြံပြုထားသည်။

စွမ်းဆောင်ရည်

1. အာရုံခံနိုင်စွမ်း-

ထောက်လှမ်းမှုအောက်ပိုင်းကန့်သတ်ချက်- ≤ 0.001pg/μL (UTP-၊ pUTP-၊ N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (5-OME-UTP-dsRNA အတွက်)။

ပမာဏ၏အောက်ပိုင်းကန့်သတ်ချက်- 0.0156 pg/μL (UTP-၊ pUTP-dsRNA), 0.0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg/μL (5-Ome-UTP-dsRNA အတွက်)။

2. တိကျမှု- Intra-Assay ၏ CV ≤10%, Inter-Assay ၏ CV ≤10%

3. ပြန်လည်ရယူခြင်း- 80% ~ 120%

4.Linearity-0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA)။

ထည့်သွင်းစဉ်းစားပါ။

1. TMB တုံ့ပြန်မှုအပူချိန်နှင့် အချိန်သည် အရေးကြီးသည်၊ ညွှန်ကြားချက်အတိုင်း ၎င်းတို့ကို တင်းတင်းကျပ်ကျပ် ထိန်းချုပ်ပါ။

2. ကောင်းမွန်သောစမ်းသပ်မှုမျိုးပွားနိုင်မှုနှင့် အာရုံခံနိုင်စွမ်းရရှိရန်၊ ပိုလျှံနေသော ဓာတ်မတည့်သောဓာတ်များကို ဖယ်ရှားရန်အတွက် ပန်းကန်ပြားများကို သင့်လျော်စွာဆေးကြောခြင်းသည် မရှိမဖြစ်လိုအပ်ပါသည်။

3. အသုံးမပြုမီ ဓါတ်ကူပစ္စည်းအားလုံးကို နှိုက်နှိုက်ချွတ်ချွတ် ရောစပ်ပြီး နမူနာ သို့မဟုတ် ဓါတ်ဆေးများ ထပ်ဖြည့်ထားစဉ်အတွင်း အဖုအထစ်များကို ရှောင်ရှားသင့်သည်။

4. crystals များ စုစည်းထားသော ဆေးကြားခံ (20x) တွင် ပုံဆောင်ခဲများ ဖြစ်ပေါ်လာပါက 37 ℃ အထိ နွေးပြီး crystal များ လုံးဝပျော်သွားသည်အထိ ညင်သာစွာ ရောမွှေပါ။

5. Sodium Azide (NaN3) ပါဝင်သောနမူနာများကို dsRNA ပမာဏကို ခန့်မှန်းတွက်ချက်မှုနည်းပါးစေသည့် HRP လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဖျက်ဆီးနိုင်သောကြောင့် စစ်ဆေးမှုအား ရှောင်ကြဉ်ပါ။

6. စစ်ဆေးနေစဉ်အတွင်း RNase ညစ်ညမ်းမှုကို ရှောင်ကြဉ်ပါ။

7. စံ/နမူနာ၊ ထောက်လှမ်းမှု ပဋိပစ္စည်းနှင့် SA-HRP တို့ကို မတုန်မလှုပ်ဘဲ RT တွင်လည်း လုပ်ဆောင်နိုင်သည်၊ သို့သော် ၎င်းသည် ထောက်လှမ်းမှု အာရုံခံနိုင်စွမ်းကို တဆမျှ လျော့ကျစေနိုင်သည်။ဤကိစ္စအတွက်၊ UTP နှင့် pUTP dsRNA စံနှုန်းများကို 2pg/μL မှ မှေးထားသင့်သည်၊ N1-Me-pUTP dsRNA စံနှုန်းများကို 4pg/μL မှ မှေးမှိန်သင့်ပြီး 5-OME-UTP dsRNA စံနှုန်းများကို 8pg/μL မှ မှေးမှိန်သင့်ပါသည်။ထို့အပြင်၊ HRP-streptavidin အလုပ်လုပ်သည့်အဖြေကို အခန်းအပူချိန်တွင် မိနစ် 60 ဖုတ်ပေးပါ။ပုလင်းဖျော်စက်သည် ရလဒ်မမှန်ကန်နိုင်သောကြောင့် ပုလင်းဖျော်စက်ကို မသုံးပါနှင့်။

ပုံမှန်ရလဒ်

1. စံမျဉ်းကွေးဒေတာ

2. စံမျဉ်းကွေး တွက်ချက်ခြင်း။

3. Liner detection range:0.0312- 1pg/μL